硒是人和动物所必需的微量元素之一，摄取硒不足或过量都会引起疾病^[1-5]。土壤是植物获取硒元素的直接来源，然而土壤中的硒全量只能作为土壤中硒含量多少的容量指标，而不能直接反映土壤中硒的生物有效性，用有效硒含量大小来评价土壤中硒对植物的供给能力更加准确^[6-7]。然而，关于土壤有效硒的测定还没有统一的测定方法。到目前为止，已有较多学者开展了对土壤中有效硒测定方法的研究工作，多种浸提剂被应用到土壤有效硒的测定中，如Keskinen等^[8]的研究成果表明磷酸盐溶液更适合作为芬兰土壤中有效硒的浸提剂；Peng等^[9]研究结果表明磷酸盐是有效的浸提剂；赵成义^[10]和李辉勇等^[11]的研究成果均表明磷酸二氢钾适用于酸性土壤有效硒的浸提；耿建梅等^[12]研究认为磷酸二氢钾适合海南稻田土壤有效硒的浸提；汤志云等^[13]研究表明，碳酸氢钠对于酸性与碱性土壤有效硒的浸提均适用；宋晓珂等^[7]则认为磷酸二氢钾和碳酸氢钠均可作为石灰性土壤有效硒的浸提剂。对于浸提剂的选取依据，大多数研究均以线性模型来研究植物体硒含量与土壤中有效硒含量的关系，并以线性相关关系是否显著来作为评判标准^[10-15]。然而，植物对土壤中硒的吸收往往受作物类型的影响，而且，有效硒与作物吸收性的良好关系常出现在盆栽试验中，在大田试验中则屡有异常。

目前对于土壤中硒的形态分析技术已相当成熟，通常采用连续提取法^[16-17]逐级提取，可以将土壤中硒分为水溶态、离子交换态、碳酸盐结合态、腐植酸结合态、铁锰氧化物结合态、强有机结合态和残渣态，其被植物利用的难易程度也依次增加。瞿建国等^[14]研究认为利用水溶态硒、交换态硒和碳酸盐结合态硒来衡量作物从土壤中吸收硒的情况更为合理；王松山^[18]通过路径分析方法研究土壤中不同形态硒与植物吸收硒的关系，得出水溶态硒、离子交换态硒和碳酸盐结合态硒是植物吸收硒的直接来源；王兆双^[19]的研究结果也表明交换态硒和碳酸盐结合态硒易于被植物吸收和累积。

因此，本文借鉴前人研究成果并结合对检测实验室的调研结果，拟选取碳酸氢钠、磷酸二氢钾、硝酸和盐酸四种浸提剂对天津果园和菜地土壤中的有效硒进行浸提，对四种浸提剂提取有效硒的含量进行比较，并希望根据浸提的硒与水溶态硒(SOL-Se)、离子交换态硒(EX-Se)和碳酸盐结合态硒(CA-Se)之间关系的统计分析，确定最优浸提剂种类。以期能准确测定土壤中硒元素的有效态含量，更好地服务于富硒土地资源的开发利用及生态农业的发展。

1.   实验部分

1.1   仪器及工作条件

AFS-3100双道原子荧光光度计(北京海光仪器公司)。仪器工作条件为：光电倍增管负高压300V，原子化器高度8mm，A道总灯电流80mA，A道辅助灯电流40mA，载气流量400mL/min，屏蔽气流量900mL/min。pHS-3C型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，SHZ-88型水浴恒温振荡器(江苏金怡仪器科技有限公司)，电热板。

1.2   标准溶液和主要试剂

1.2.1   标准溶液

硒标准储备溶液(100.0μg/mL)配制：称取0.1000g高纯硒粉，加入20mL硝酸，在电热板上低温加热至溶解完全。取下冷却，移入1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。硒标准溶液由此标准储备溶液稀释配制。

碳酸氢钠(0.5mol/L)配制：称取42.0g碳酸氢钠，加水溶解后，稀释至1000mL。如果pH偏低，则用4mol/L氢氧化钠溶液调至8.5，然后加水稀释至刻线，摇匀。

磷酸二氢钾(0.1mol/L)配制：称取13.6g磷酸二氢钾溶于少量水中，将溶液转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻线，摇匀。

硝酸(0.4mol/L)配制：量取27.2mL浓硝酸1000mL容量瓶中，加水稀释至刻线，摇匀。

盐酸(0.1mol/L)配制：量取8.2mL浓盐酸于1000mL容量瓶中，加水稀释至刻线，摇匀。

1.2.2   主要试剂

碳酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化镁、醋酸钠、焦磷酸钠、硼氢化钾、硼氢化钠。

硝酸、盐酸、铁盐、王水、高氯酸、氢氟酸、盐酸羟铵-盐酸混合液、过氧化氢、醋酸铵-硝酸混合液：所有试剂均为分析纯。实验用水为一级水。

1.3   样品采集与加工

天津地形以山地和平原为主，仅蓟州北部为山地，其余均属冲积平原。本次供试土壤采集自天津市西青区和蓟州区北部。西青区位于天津中心城区周边，是天津市主要的蔬菜生产基地，本次采样点主要分布于菜地，采样深度为0~20cm，在西青区采集土壤样品40件；蓟州区北部的采样点主要分布于果园，采样深度为0~40cm，如土层厚度不足40cm，按实际厚度采集，采集土壤样品60件。采样时避开沟渠、林带、田埂、路边、旧房基、粪堆及微地形高低不平无代表性地段。每个点位样品均由3~5个子样混合而成，样品量至少1kg，带回实验室，自然风干，去除植物根系，然后全部通过20目的尼龙筛。过筛后土壤样品经混匀后分取200g，采用玛瑙无污染制备机将样品粉碎至200目，装入牛皮纸袋作为分析样品。

1.4   样品测试分析与质量控制

目前土壤有效硒测定方法较多，本研究参照报道较多且被众多学者广泛采用的浸提方法^[10-15]测试有效硒含量。

参照李辉勇等^[11]的方法：称取5g土壤样品，加入0.5mol/L碳酸氢钠(pH=8.5)25mL，振荡2h，离心；参考赵成义^[10]的方法：称取5g土壤样品，加入0.1mol/L磷酸二氢钾25mL，振荡2h，离心；参考国土资源部合肥矿产资源监督检测中心测试方法^[20]：称取5g土壤样品，加入0.4mol/L硝酸50mL，振荡1h，离心；参考国土资源部天津矿产资源监督检测中心测试方法^[21]：称取5g土壤样品，加入0.1mol/L盐酸25mL，振荡1.5h，离心。分别分取上述上清液10mL于小烧杯中，加入王水和高氯酸进行消化，消化后滤液依次加入4mL浓盐酸和1mL铁盐，定容至10mL，用原子荧光光度计进行测定。硒的形态分析方法参照《生态地球化学评价样品分析技术要求(试行)》(DD2005-03)，全量硒的分析方法参照《土壤中全硒的测定》(NY/T 1104—2006)，pH值测定参照《森林土壤pH值的测定》(LY/T 1239—1999)。

全量硒分析中插入国家标准物质GBW07425、GBW07428、GBW07453和GBW07456来控制准确度；硒的形态分析中插入国家标准物质GBW07442和GBW07443同时以土壤中元素全量分析作为标准，与各形态之和进行比较来控制测试分析的准确度；全量硒、有效硒和硒的形态分析均采用对同一件样品重复分析12次的方法控制样品分析的精密度。本次样品分析均满足《生态地球化学评价样品分析技术要求(试行)》(DD2005-03)和《土地质量地球化学评价规范》(DZ/T 0295—2016)中的质量要求。

2.   结果与讨论

2.1   四种浸提剂的提取量对比

在菜地土壤中，碳酸氢钠和磷酸二氢钾提取有效硒的平均含量均为0.039mg/kg(表 1)，显著高于硝酸和盐酸的提取量，两者提取有效硒的平均含量分别为0.028mg/kg和0.027mg/kg，硝酸和盐酸在提取有效硒含量方面没有差异性。在果园土壤中，碳酸氢钠、磷酸二氢钾、硝酸和盐酸提取有效硒的平均含量依次降低，分别为0.038mg/kg、0.021mg/kg、0.012mg/kg和0.005mg/kg，四种浸提剂提取有效硒的含量存在显著的差异性。在菜地和果园土壤中，用碳酸氢钠提取的有效硒含量几乎一致，但是在菜地用磷酸二氢钾、硝酸和盐酸提取的有效硒含量分别高于果园同种浸提剂的提取量。

表  1  四种浸提剂提取有效硒含量

Table  1.  Available Se contents extracted by four extractants including NaHCO₃, KH₂PO₄, HNO₃ and HCl

土壤类型	提取的硒含量(mg/kg)				样本量(件)
	碳酸氢钠	磷酸二氢钾	硝酸	盐酸
菜地	0.039±0.010	0.039±0.012	0.028±0.013	0.027±0.016	40
果园	0.038±0.009	0.021±0.006	0.012±0.005	0.005±0.002	60

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碳酸氢钠属于碱性浸提剂，可溶解某些铁、铝、钙的含硒化合物，而且碳酸氢根在振荡过程中可以转化成碳酸根，并且可与土壤溶液中的铁、铝、钙结合成沉淀，从而可以释放出吸附态的亚硒酸根和硒酸根，所以碳酸氢钠提取的有效硒含量较高^[22-24]。磷酸二氢钾属于酸性溶液，除了能够浸提土壤中可交换态硒外，还可以提取部分与土壤结合的无定形硒和有机硒^[25]，所以磷酸二氢钾提取的有效硒含量也很高。Keskinen等^[8]的研究成果表明在土壤中竞争结合点位时，磷酸根离子有较强的结合能力；李辉勇等^[11]和吴雄平等^[15]的研究成果也均证实磷酸二氢钾作为浸提剂，不仅提取量高，而且操作简便，重复性好。硝酸和盐酸对有效硒的浸提主要是依靠酸溶作用，因此其提取能力较弱。

2.2   四种浸提剂提取有效硒的相关性

菜地土壤四种浸提剂提取有效硒的含量均表现出较好的相关性(表 2)，其中碳酸氢钠和磷酸二氢钾、硝酸和盐酸的相关系数分别高达0.900和0.885。同样，果园土壤也表现出相同的相关性趋势(表 3)，但对应的相关系数分别小于菜地土壤。两类土壤用四种浸提剂提取的有效硒含量与土壤全量硒均呈现显著的相关性，说明无论哪种浸提剂提取的有效硒含量，均受控于土壤中的全量硒^[26-29]。土壤全量硒代表土壤硒水平的高低，虽然不能反映土壤对作物提供可吸收利用的硒量，然而作为土壤有效硒的来源，对有效硒具有基本的调节作用。而且，在土壤硒有效性一定的条件下，全硒含量较高的土壤能够向作物提供较多的有效硒^[30]。

表  2  菜地土壤四种浸提剂提取有效硒含量及土壤全量硒的相关系数

Table  2.  Correlation coefficients between available Se extracted by NaHCO₃, KH₂PO₄, HNO₃, HCl and total Se in vegetable soils

浸提剂	碳酸氢钠	磷酸二氢钾	硝酸	盐酸	全量硒
碳酸氢钠	1	-	-	-	-
磷酸二氢钾	0.900Δ	1	-	-	-
硝酸	0.811Δ	0.761Δ	1	-	-
盐酸	0.791Δ	0.837Δ	0.885Δ	1	-
全量硒	0.777Δ	0.726Δ	0.903Δ	0.786Δ	1
注：Δ表示相关性达极显著(p < 0.01)水平，样本量n=40。

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表  3  果园土壤四种浸提剂提取有效硒含量及土壤全量硒的相关系数

Table  3.  Correlation coefficients between available Se extracted by NaHCO₃, KH₂PO₄, HNO₃, HCl and total Se in orchard soils

浸提剂	碳酸氢钠	磷酸二氢钾	硝酸	盐酸	全量硒
碳酸氢钠	1	-	-	-	-
磷酸二氢钾	0.681Δ	1	-	-	-
硝酸	0.425Δ	0.313*	1	-	-
盐酸	0.461Δ	0.418Δ	0.700Δ	1	-
全量硒	0.806Δ	0.707Δ	0.402Δ	0.397Δ	1
注：Δ表示相关性达极显著(p < 0.01)水平，*表示相关性达显著(p < 0.05)水平，样本量n=60。

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2.3   硒的形态分析

菜地土壤中强有机结合态、残渣态、腐植酸结合态、水溶态、铁锰氧化物结合态、离子交换态和碳酸盐结合态硒的含量依次降低(表 4)。其中强有机结合态和残渣态是土壤中硒的主要赋存形态，占总硒的百分比分别为42.5%和37.4%，水溶态、离子交换态和碳酸盐结合态硒之和占总硒的百分比为8.0%(图 1)。果园土壤也同样是以强有机结合态硒和残渣态硒为主，两者占总硒的百分含量分别为43.9%和34.6%，水溶态、离子交换态和碳酸盐结合态硒之和占总硒的百分比为7.2%(图 1)。青海平安地区超过87%的土壤硒以有机结合态和残渣态为主^[31]；王松山等^[32]对我国16种典型农田土壤硒的形态分析表明，江西红壤和黑龙江黑土中的硒主要以残渣态存在，其余土壤中硒主要以有机结合态存在。土壤中各形态硒含量受控于土壤中的总硒含量，由高含硒母岩发育而成的土壤中，残渣态硒的含量较高，在岩石风化过程中，硒可向风化程度高的土壤中富集，这种土壤多含有丰富的土壤胶体和有机质组分，因此强有机结合态硒的含量较高^{[18, 33]}。

表  4  菜地和果园土壤各形态的硒含量

Table  4.  Content of different combined form Se in vegetable and orchard soils

土壤类型	水溶态硒(mg/kg)	离子交换态硒(mg/kg)	碳酸盐结合态硒(mg/kg)	腐植酸结合态硒(mg/kg)	铁锰氧化物结合态硒(mg/kg)	强有机结合态硒(mg/kg)	残渣态硒(mg/kg)	全量硒(mg/kg)
菜地	0.022±0.008	0.007±0.001	0.004±0.001	0.042±0.014	0.010±0.005	0.182±0.062	0.160±0.094	0.644±0.259
果园	0.015±0.003	0.005±0.001	0.003±0.001	0.039±0.011	0.007±0.002	0.140±0.043	0.110±0.029	0.370±0.100
注：形态分析中菜地和果园的样本量n分别为10和9；全量硒分析中菜地和果园的样本量n分别为40和60。

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图  1  各形态硒在总硒中的占比

Figure  1.  Percentage of different combined form Se in vegetable and orchard soils

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2.4   最优浸提剂

菜地土壤中水溶态+离子交换态+碳酸盐结合态(以下简称“三形态硒”)的最小值、25%处数据值、中位数、75%处数据值以及最大值均明显高于硝酸和盐酸提取有效硒的对应值(图 2a)，与碳酸氢钠和磷酸二氢钾提取有效硒含量的对应值较为接近，三形态硒、碳酸氢钠和磷酸二氢钾提取有效硒的最小值分别为0.026mg/kg、0.027mg/kg和0.027mg/kg；中位数分别为0.035mg/kg、0.035mg/kg和0.031mg/kg；最大值分别为0.050mg/kg、0.057mg/kg和0.058mg/kg。分别对三形态硒与碳酸氢钠、三形态硒与磷酸二氢钾进行独立样本的T检验，结果显示三种形态的含量之和与上述两种浸提剂提取的有效硒含量没有显著差异(p>0.05, n=10)。

图  2  菜地(a)和果园(b)土壤中有效硒与水溶态硒、离子交换态硒、碳酸盐结合态硒之和的含量对比

Figure  2.  Comparison of available Se and the sum of SOL-Se, EX-Se and CA-Se in (a) vegetable and (b) orchard soils

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果园土壤中三形态硒的最小值、25%处数据值、中位数、75%处数据值以及最大值与磷酸二氢钾提取有效硒的对应值几乎一致(图 2b)，三形态硒和磷酸二氢钾提取有效硒的最小值分别为0.011mg/kg和0.014mg/kg，中位数分别为0.023mg/kg和0.022mg/kg，最大值分别为0.035mg/kg和0.031mg/kg，而且独立样本的T检验结果显示两者没有明显差异性(p>0.05, n=9)。综合上述分析结果，碳酸氢钠和磷酸二氢钾均适合作为天津菜地土壤有效硒的浸提剂，以磷酸二氢钾为优，且磷酸二氢钾也适合作为天津果园土壤有效硒的浸提剂。周越等^[24]的研究也认为在众多浸提剂中，碳酸氢钠和磷酸二氢钾对有效硒的提纯效果最好。姚欢等^[34]和谢珊妮等^[35]在研究土壤硒的有效性时直接选用磷酸二氢钾作为浸提剂，可见，磷酸二氢钾作为有效硒的浸提剂已被众多学者所接受。磷酸根比亚硒酸根离子具有更强的交换能力，因此，磷酸根可迅速取代吸附在矿物上的亚硒酸根，同时，磷酸二氢钾的水溶液呈微酸性，能溶解与碳酸盐结合态共存的硒酸盐和亚硒酸盐^[36-38]，也进一步说明了水溶态硒、离子交换态硒和碳酸盐结合态硒是能够被植物吸收的形态。

3.   结论

本研究根据浸提的有效硒与水溶态硒、离子交换态硒和碳酸盐结合态硒之间的关联性，确定了磷酸二氢钾适合作为天津果园和菜地土壤有效硒的浸提剂。本研究工作不同于以往采取室内盆栽试验的方式确定最优浸提剂种类，而是以野外采集的土壤样品为分析对象进行统计分析，既减小了植物对有效硒浸提剂选取的影响，又使有效硒浸提剂的选取依据多元化。

本研究工作在最优浸提剂的选取方面作了有益的尝试，但是还需要大量样本的支持；同时，彻底解决有效硒的测试方法问题还需要进一步深入研究。