Determination of Nitrogen Isotope of Water Samples with Low Ammonium Nitrogen by Ion Exchange Method
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摘要: 采用氯化铵、氯化钾为原料的离子交换色层法结合扩散法处理低浓度铵态氮水样,测定其铵态氮同位素时,减小全流程空白、避免同位素分馏、获取准确的铵态氮同位素值是需解决的关键问题。本文建立一套尽可能密闭的离子交换系统,避免了在大气环境下低浓度铵态氮水样在离子交换色层预处理过程中的污染;采用蠕动泵过柱的方法,调节蠕动泵的转速控制氯化铵溶液的过柱速率为1.2 L/h,洗脱速率为0.2 L/h,缩短了样品处理时间,减少了空气对铵态氮样品的污染,样品中的NH4+可完全被阳离子交换树脂吸附,铵态氮回收率为93.5%~102.8%,且不会引起氮同位素分馏;将优级纯氯化钾试剂置于450℃马弗炉中灼烧24 h,降低了氯化钾试剂引入的铵态氮污染。建立的方法使全流程的铵态氮空白浓度低于检出限0.02 mg/L,解决了在大气环境下采用离子交换色层法处理低浓度铵态氮水样的污染问题,加速了样品前处理的过程,提高了样品处理效率。
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关键词:
- 低浓度铵态氮水样 /
- 铵态氮同位素 /
- 离子交换色层法 /
- 扩散法 /
- 元素分析仪-同位素比值质谱法
Abstract: When the δ15N-NH4+ in water samples is pretreated by using the ion exchange and diffusion method with NH4Cl and KCl, the key problem is how to reduce the blank, avoid isotopic fractionation and yield accurate isotope results. In this study, a closed ion exchange system was set up to prevent the small amount of NH4+ contamination to the water samples. Furthermore, the sample and elution flow rates of 1.2 L/h and 0.2 L/h respectively were achieved by adjusting the speed of a peristaltic pump. Thus, both the experiment time and the contamination were reduced. In addition, all of the NH4+ in the sample is absorbed on the ion exchange resin and the N recoveries were from 93.5% to 102.8%. Therefore, the whole process will not cause isotopic fractionation. The blank introduced by KCl was reduced by being heated at 450℃ for 24 h. As a result, the blank ion exchange was reduced to below the detection limit of 0.02 mg/L by using the closed ion exchange system. The problem of contamination for water sample pretreatment in air was solved. The process was accelerated and efficiency was improved -
镉对植物具有一定的毒害性,不仅能与蛋白质及酶活性中心的巯基结合,而且还能取代金属蛋白中的必需元素,导致生物结构的改变与酶活性的丧失,从而干扰细胞的正常代谢过程。为了减少其毒害效应,植物在长期进化中产生了多种抵抗重金属毒害的防御机制,并通过调控金属的吸收、积累、运输和耐受过程,在植物体内形成复杂的耐受机制[1-3]。
螯合作用是植物对细胞内重金属耐受的主要方式之一,谷胱甘肽、草酸、苹果酸和柠檬酸盐等小分子物质,植物螯合肽(PCs)和金属巯基蛋白都能螯合重金属[4-5]。PCs是一种富含巯基的寡肽,结构通常为(-Glu-Cys)n-Gly(n等于2~11)[6]。PCs在植物耐重金属毒害中的作用已有许多报道,但用超积累植物所作的实验并未得出一致的结论[7-12]。通常认为,PCs对重金属耐受的机理是重金属离子进入植物体后,与细胞内的PCs结合形成复合物,然后转运到特定的细胞器(主要为液泡)进行区室化固定,进而防止其干扰细胞的新陈代谢。Wei等[13]研究表明,虽然在Cd胁迫下,PCs可能参与了Cd的长距离运输,PCs和GSH(或cys)与Cd的结合也有竞争。di Toppi等[14]指出,植物对不同浓度水平的镉的反应是一个非常复杂的现象,可能会有很多不同的机制同时起作用。然而,也有报道[15-16]指出PCs在金属耐受机制中仅有短暂的作用,与超积累植物的高耐受性并不总是相关。部分研究证实了植物络合素与Cd、Ni、Zn、Co和As的超积累无关[17-18]。例如,Ebbs等[19]研究显示,PCs的合成与超积累对Cd的超积累与耐性无关。同时,对Cd/Zn共超积累植物东南景天研究发现,超积累东南景天对重金属的耐性和积累与PCs无关,而推测GSH可在体内参与重金属解毒过程[20-21]。
关于PCs的合成机制同样存在争议。研究证明,PCs由谷胱甘肽(GSH)为底物的酶促反应合成[22]。关于GSH如何生成PCs,研究者普遍赞同由γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基转肽酶,即植物螯合肽合成酶催化合成的观点。Grill等[23]通过蝇子草属(Silenecucubalis)细胞培养,以GSH为底物首次合成了PCs。但是,也有报道称PCs通常在超积累和非超积累植物的根部由Cd胁迫直接产生[18, 24]。
本文针对PCs在植物耐重金属毒害中的作用及PCs的合成机制开展研究,采用体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-HPLC-ICPMS)技术[25-26]分析超积累植物印度芥菜(Brassica Juncea)不同部位Cd的含量,考察不同Cd胁迫浓度和胁迫时间条件下镉形态的分布规律,初步探讨了胁迫浓度、胁迫时间和镉耐受性之间的关系和PCs的合成机制。
1. 实验部分
1.1 仪器及主要试剂
Agilent 7500a型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)。工作参数:射频功率1350 W;采样深度5.7 mm;Babinton型雾化器;载气流速1.10 L/min;采样模式:时间分辨;采样时间2000 s;样品提升速率1 mL/min。
Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。色谱柱:TSK-GEL G3000分离柱及TSK-GELTM PW保护柱,流速0.8 mL/min,进样量100 μL,自动进样。
水:去离子水再经Milli-Q装置纯化(电阻率>18 MΩ·cm)。
Cd标准溶液:用10 mmol/L EDTA配制1.14 mg/L的EDTA-Cd溶液,对Cd未知峰进行定量,使用时按需要逐级稀释。
流动相:配制10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液,再加入0.1 mol/L NaCl,调节pH=7.5,用0.45 μm滤膜过滤,氮气鼓泡赶干净溶解氧。
1.2 植物培养
印度芥菜种子撒在珍珠岩上,用蛭石覆盖完全。放入周转箱内,周转箱内放少量水至没过箱底,外加少量Ca(NO3)2营养液(不超5 mmol/L)。蒙上实验用纱布,置于培养箱中,温度设置为28℃。待发育出两片子叶,取出,光照下培养。待长出的子叶完全伸展开,开始补加1/4营养液。待苗茁壮,开始间苗至周转箱。周转箱内放1/4营养液,5天后换全营养液培养。以后每3天更换一次营养液。植株长成后,用不同浓度的Cd标准溶液进行刺激。
1.3 样品处理
取一定量的Cd标准溶液培养的鲜叶片和根系样品,在液氮中浸泡后,于干净的玛瑙研钵中研磨。加入1.00 g干净石英砂、5.00 mL缓冲液,将样品研磨至浆状。磨碎后转移至10 mL离心管,用Tris-HCl清洗研钵,一并转移入离心管。在4℃离心10 min,转速为10000 r/min,上层清液转移入干净离心管置于冰箱(-70℃)保存。分析前,将样品从冰柜中取出,氮气保护下解冻,0.2 μm滤膜过滤后快速用SEC-HPLC-ICPMS分析。
2. 结果与讨论
2.1 镉形态的分离与检测
用文献[25]的分析检测方法,在实际样品中检测出4种镉形态,初步推断保留时间13.5 min处为Cys-Cd,10.2 min为GSH-Cd,8.8 min为(PC)2-Cd,7.8 min为(PC)3-Cd,谱图如图 1所示。为了考察PCs的合成机制及其在镉耐受性的作用,本工作重点研究了GSH-Cd、(PC)2-Cd和(PC)3-Cd的变化规律。
2.2 胁迫浓度对镉形态的影响
分别用0.5、1、3、5、10 μg/mL镉标准溶液进行刺激后,植物体内镉形态如图 2所示。可以看出,根中镉形态含量总和与刺激浓度呈正相关,随着刺激浓度的增大,根部镉形态浓度明显增大。而在叶中,刺激浓度为3 μg/mL时,镉浓度达到最大值,之后开始下降,至10 μg/mL时反而降至最低。说明PCs只有在低浓度镉胁迫下能够提高镉耐受性。
低浓度刺激时,根部的Cd以GSH-Cd形态为主;随着刺激浓度的增加,(PC)2-Cd和(PC)3-Cd逐渐增加。而在叶部,Cd的三种形态GSH-Cd、(PC)2-Cd、(PC)3-Cd均能检出,以(PC)2-Cd为主,但随着刺激浓度的变化,三种形态均先增大后减少。说明PCs一部分是由GSH转化生成,一部分是在镉的胁迫下直接产生。
2.3 胁迫时间对镉形态的影响
用相同浓度的镉溶液分别对植物连续刺激24、48、72、96 h,植物体内的镉形态分布如图 3所示。可以看出,随着刺激时间的增加,根中GSH-Cd浓度先迅速增加,72 h达到最高值,而后逐渐降低,96 h降至最低。(PC)2-Cd、(PC)3-Cd也是先迅速增加,而后缓慢降低,96 h降至最低。在叶片中,GSH-Cd、(PC)2-Cd、(PC)3-Cd浓度先迅速增加,48 h达到最高值,而后逐渐降低,96 h降至最低。
随着刺激时间的延长,叶片中GSH-Cd、(PC)2-Cd、(PC)3-Cd三种形态均能检出,但始终以(PC)2-Cd形态为主。根部也能检测出三种形态,刺激48 h、72 h时以GSH-Cd为主,但96 h时以(PC)2-Cd、(PC)3-Cd为主。同时,叶片中PCs-Cd要高于根部。
而刺激时间对Cd总量在植物不同部位的分布影响规律为:随着刺激时间增加,Cd含量持续增加,且根部远远大于叶片。PCs浓度的降低表明在植物耐镉机制中PCs起部分作用,受高浓度Cd胁迫时,其他机制可能会被激发。
3. 结语
本工作利用已建立的SEC-HPLC-ICPMS分析方法测定超积累植物印度芥菜叶片和根中的镉形态,并研究了胁迫浓度和胁迫时间对镉形态分布的影响。研究表明,植物体内镉的形态及含量与胁迫浓度和胁迫时间密切相关,且形态之间会相互转化,说明PCs在镉解毒机制中仅有短暂的作用;持续高浓度胁迫下,植物会引发其他机制来抵抗镉的毒性。也证实了PCs一部分是由GSH转化生成,一部分是在镉的胁迫下直接产生。因此认为,研究植物螯合肽在镉解毒机制中的作用需要考虑胁迫浓度和胁迫时间这两个重要参数。
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表 1 开放系统和尽量密闭系统中离子交换流程空白和回收率
Table 1 Blank and yield of N for NH4+ ion exchange under air and closed system
离子交换树脂柱编号 样品 处理体积V/mL ρB/(mg·L-1) 洗脱液NH4+-N含量m/mg 回收率/% NH4+-N-上柱前 NH4+-N-上柱后 1# 流程空白1a 450 0.00 0.17 nd nd 2# 流程空白2a 700 0.00 0.38 nd nd 3# 流程空白3a 1500 0.00 nd 0.66 nd 4# 标准溶液1a 450 0.12 0.17±0.01(n=5) nd nd 5# 标准溶液2a 700 0.12 0.45±0.01(n=5) nd nd 6# 标准溶液3a 1500 0.12 nd 0.66 nd 7# 流程空白1b 450 0.00 <0.02 小于检出限 nd 8# 流程空白2b 1500 0.00 <0.02 小于检出限 nd 9# 标准溶液1b 450 0.56 <0.02 0.24 94.8 10# 标准溶液2b 1500 0.10 <0.02 0.15 102.7 注:a和b分别表示在开放系统和尽量密闭的系统下进行离子交换过程。nd表示未检出。 表 2 过柱和洗脱速率对离子交换过程的影响
Table 2 Effect of column rate and eluting rate on ion exchange procedure
离子交换
树脂柱编号ρ(NH4+-N)/
(mg·L-1)V/mL 过柱速率/
(L·h-1)洗脱速率/
(L·h-1)回收率/
%1# 0.5 500 0.3 0.05 95.1 2# 0.5 500 1.2 0.05 103.2 3# 0.5 500 1.2 0.05 101.2 4# 0.5 450 0.9 0.05 96.1 5# 0.5 450 0.9 0.05 93.5 6# 0.1 1500 0.9 0.2 102.8 7# 0.1 1500 0.9 0.2 102.8 -
Hastings M G, Jarvis J C, Steig E J. Anthropogenic impacts on nitrogen isotopes of ice-core nitrate [J].Science, 2009, 324: 1288. doi: 10.1126/science.1170510
罗绪强,王世杰,刘秀明.稳定氮同位素在环境污染示踪中的应用进展[J].矿物岩石地球化学通报,2007, 26(3): 295-299. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-KYDH200703018.htm Xing M, Liu W G. Variations in the concentration and isotopic composition of nitrate nitrogen in wet deposition and their relation with meteorological conditions in Xi′an city, Northwest China [J].Applied Geochemistry, 2012, 27: 831-840. doi: 10.1016/j.apgeochem.2012.01.003
Liu W G, Xing M. Isotopic indicators of carbon and nitrogen cycles in river catchments during soil erosion in the arid Loess Plateau of China [J].Chemical Geology, 2012, 296-297: 66-72. doi: 10.1016/j.chemgeo.2011.12.021
李思亮,刘丛强,肖化云,陶发祥,郎贇超,韩贵琳.δ15N在贵阳地下水氮污染来源和转化过程中的辨识应用[J].地球化学, 2005, 34(3): 257-262. 金赞芳,叶红玉.氮同位素方法在地下水氮污染源识别中的应用[J].环境污染与防治,2006,28(7): 531-535. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HJWR200607014.htm 宁卓,张翠云,张胜.地下水铵污染及其氮同位素研究[J].南水北调与水利科技, 2011, 9(3): 129-132. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-NSBD201103033.htm 曹亚澄,孙国庆,施书莲.土壤中不同含氮组分的δ15N质谱测定法[J].土壤通报, 1993, 24(2): 87-90. Rock L, Ellert B H. Nitrogen-15 and oxygen-18 natural abundance of potassium chloride extractable soil nitrate using the denitrifier method [J].Soil Science Society of America Journal, 2007, 71: 355-361. doi: 10.2136/sssaj2006.0266
Silva S R, Kendalla C, Wilkisonb D H, Ziegler A C, Chang C C Y, Avanzino R J. A new method for collection of nitrate from fresh water and the analysis of nitrogen and oxygen isotope ratios [J].Journal of Hydrology, 2000, 228: 22-36. doi: 10.1016/S0022-1694(99)00205-X
Sigman D M, Casciotti K L, Andreani M, Barford C, Galanter M, Böhlke J K. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater [J].Analytical Chemistry, 2001,73: 4145-4153. doi: 10.1021/ac010088e
肖化云,刘丛强.水样氮同位素分析预处理方法的研究现状与进展[J].岩矿测试, 2001, 20(2): 125-130. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YKCS200102009.htm Johnston A M, Scrimgeour C M, Kennedy H, Handley L L.Isolation of ammonium-N as 1-sulfonato-iso-indole for measurement of δ15N [J].Rapid Communication in Mass Spectrometry, 2003, 17: 1099-1106. doi: 10.1002/(ISSN)1097-0231
Xing M, Liu W G. An improved method of ion exchange for nitrogen isotope analysis of water nitrate [J].Analytica Chimica Acta, 2011, 686: 107-114. doi: 10.1016/j.aca.2010.11.051
Huber B, Bernasconi S M, Luster J, Pannatier E G. A new isolation procedure of nitrate from freshwater for nitrogen and oxygen isotope analysis [J].Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2011, 25: 3056-3062. doi: 10.1002/rcm.5199
Velinsky D J, Pennock J R, Sharp J H, Cifuentes L A, Fogel M L. Determination of the isotopic composition of ammonium-nitrogen at the natural abundance level from estuarine waters [J].Marine Chemistry, 1989, 26: 351-361. doi: 10.1016/0304-4203(89)90040-6
Goerges T, Dittert K. Improved diffusion technique for 15N:14N analysis of ammonium and nitrate from aqueous samples by stable isotope spectrometry [J].Communications in Soil Science and Plant Analysis, 1998, 29(3-4): 361-368. doi: 10.1080/00103629809369950
Holmes R M, McClelland J W, Sigman D M, Fry B, Peterson B J. Measuring 15N-NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations [J].Marine Chemistry, 1998, 60: 235-243. doi: 10.1016/S0304-4203(97)00099-6
Sebilo M, Mayer B, Grably M, Billiou D, Mariotti A. The use of the ‘ammonium diffusion’ method for 15N-NH4+ and 15N-NO3- measurements: Comparison with other techniques [J].Environmental Chemistry, 2004, 1: 99-103. doi: 10.1071/EN04037
Stephan K, Kavanagh K L. Suitability of the diffusion method for natural abundance nitrogen-15 analysis [J].Soil Science Society of American Journal, 2009, 73: 293-302. doi: 10.2136/sssaj2007.0079
Downs M, Michener R, Fry B. Nadelhoffer K.Routine measurement of dissolved inorganic 15N in precipitation and streamwater [J].Environmental Monitoring and Assessment, 1999, 55: 211-220. doi: 10.1023/A:1006194307747
Xiao H Y, Liu C Q. A fast method to prepare water samples for 15N analysis [J].Science in China (Series E), 2001, 44: 105-107. doi: 10.1007/BF02916798
Lehmann M F, Bernasconi S M, McKenzie J A. A method for the extraction of ammonium from freshwaters for nitrogen isotope analysis [J].Analytical Chemistry, 2001, 73: 4717-4721. doi: 10.1021/ac010212u
肖化云,刘丛强.水样硝酸盐氮同位素分析预处理方法探讨[J].岩矿测试, 2002,21(2): 105-108. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YKCS200202003.htm Mulvaney R L, Khan S A. Use of diffusion to determine inorganic nitrogen in a complex organic matrix [J].Soil Science Society of America Journal, 1999, 63: 240-246. doi: 10.2136/sssaj1999.03615995006300010035x
Brooks P D, Stark J M, McInteer B B, Preston T. Diffusion method to prepare soil extracts for automated nitrogen-15 analysis [J].Soil Science Society of America Journal, 1989, 53: 1707-1711. doi: 10.2136/sssaj1989.03615995005300060016x
Stark J M, Hart S C. Diffusion technique for preparing salt solutions, kjeldahl digests, and persulfate digests for nitrogen-15 analysis [J].Soil Science Society of America Journal, 1996, 60: 1846-1855. doi: 10.2136/sssaj1996.03615995006000060033x
Mulvaney R L, Khan S A, Stevens W B, Mulvaney C S. Improved diffusion methods for determination of inorganic nitrogen in soil extracts and water [J].Biology and Fertility of Soils, 1997, 24: 413-420. doi: 10.1007/s003740050266
胡婧,刘卫国.扩散法-EA-IRMS测定天然水体铵态氮同位素实验条件研究[J].矿物岩石地球化学通报, 2010, 29(1): 31-37. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-KYDH201001005.htm Robinson D.δ15N as an integrator of the nitrogen cycle [J].Trends in Ecology & Evolution, 2001, 16(3): 153-162.
肖化云,刘丛强.氮同位素示踪贵州红枫湖河流季节性氮污染[J].地球与环境, 2004, 32(1): 71-75. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-DZDQ200401012.htm 肖化云,刘丛强,李思亮.贵阳地区夏季雨水硫和氮同位素地球化学特征[J].地球化学, 2003, 32(3): 248-254. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-DQHX200303005.htm