Study on the Influence of Pre-treatment Conditions of Poly-nuclear Aromatic Hydrocarbons Samples of Geochemical Exploration for Oil and Gas
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摘要: 在油气化探工作中，稠环芳烃含量对区域油气异常有着重要的指示作用。对于稠环芳烃的测定，诸多前处理条件对稠环芳烃的提取效率有显著的影响。本文研究了油气化探样品振荡提取法的多种前处理条件（提取溶剂、样品粒径、振荡时间和静置时间、提取温度）对荧光强度测定结果的影响。实验结果表明，提取溶剂不同，测定结果存在较大差异，各提取溶剂的提取效率大小依次为：二氯甲烷>正己烷>乙酸乙酯>石油醚。综合考虑溶剂背景值对测定结果的影响，选择以正己烷为提取溶剂进行条件实验。在研究的粒径范围内，荧光强度随样品粒径的减小而增大，但粒径过小荧光强度反而降低，粒径在0.125~0.090 mm之间的样品荧光强度最高；荧光强度随着振荡时间和静置时间的增加而增强，其中静置时间的影响较大，静置9 h后荧光强度提高不显著；振荡时间的影响相对较小，振荡20 min后提取效率提高不显著；提取温度对荧光强度的影响最为显著，在相同条件下，提取温度越高荧光强度越大，且提取温度是影响稠环芳烃测定结果重现性的关键因素。油气化探样品前处理的最优化条件为：采用粒径在0.090~0.177 mm之间的样品，以色谱纯正己烷为溶剂，提取温度25℃，振荡时间20 min，静置时间12 h。Abstract: The content of poly-nuclear Aromatic Hydrocarbons is a very important index to trace abnormalities in regional oil and gas for geochemical exploration samples. The extraction efficiency of the target compounds is influenced by many pre-treatment conditions such as extraction solvents, grain size, shaking time, standing time and extraction temperature. The above-mentioned conditions were studied systematically in this research with oscillation extraction for oil and gas geochemical exploration samples. Based on research results, the solvent plays an important role in preparation. The extraction efficiency of solvents in turn from high to low are dichloromethane, n-hexane, ethyl acetate and petroleum ether. Considering the background effect of different solvents to measured results, the n-hexane was selected to study the experimental conditions. The fluorescence intensity was reduced when grain size was below 0.090 mm. Satisfactory data can be obtained when sample grain size is between 0.125-0.090 mm. The fluorescence intensity was increased simultaneously with increasing oscillation time and hold time. When the hold time extended to 9 h, the extraction efficiency was improved insignificantly. The oscillation time has a minor effect on extraction efficiency while more than 20 min oscillation time does not improve the extraction efficiency. The extraction temperature plays an important role for extraction efficiency. Under the same conditions, the fluorescence intensity was increased when the temperature was raised. The temperature is the most important factor for the repeatability test. The experimental conditions were optimized with grain size of 0.125-0.090 mm, solvent of dichloromethane, extraction temperature of 25℃, 20 min shaking time, and 12 h hold time.
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镉对植物具有一定的毒害性,不仅能与蛋白质及酶活性中心的巯基结合，而且还能取代金属蛋白中的必需元素，导致生物结构的改变与酶活性的丧失，从而干扰细胞的正常代谢过程。为了减少其毒害效应，植物在长期进化中产生了多种抵抗重金属毒害的防御机制，并通过调控金属的吸收、积累、运输和耐受过程，在植物体内形成复杂的耐受机制[1-3]。
螯合作用是植物对细胞内重金属耐受的主要方式之一，谷胱甘肽、草酸、苹果酸和柠檬酸盐等小分子物质，植物螯合肽(PCs)和金属巯基蛋白都能螯合重金属[4-5]。PCs是一种富含巯基的寡肽，结构通常为(-Glu-Cys)n-Gly(n等于2～11)[6]。PCs在植物耐重金属毒害中的作用已有许多报道，但用超积累植物所作的实验并未得出一致的结论[7-12]。通常认为，PCs对重金属耐受的机理是重金属离子进入植物体后,与细胞内的PCs结合形成复合物,然后转运到特定的细胞器(主要为液泡)进行区室化固定，进而防止其干扰细胞的新陈代谢。Wei等[13]研究表明，虽然在Cd胁迫下，PCs可能参与了Cd的长距离运输，PCs和GSH(或cys)与Cd的结合也有竞争。di Toppi等[14]指出，植物对不同浓度水平的镉的反应是一个非常复杂的现象，可能会有很多不同的机制同时起作用。然而，也有报道[15-16]指出PCs在金属耐受机制中仅有短暂的作用，与超积累植物的高耐受性并不总是相关。部分研究证实了植物络合素与Cd、Ni、Zn、Co和As的超积累无关[17-18]。例如，Ebbs等[19]研究显示，PCs的合成与超积累对Cd的超积累与耐性无关。同时，对Cd/Zn共超积累植物东南景天研究发现，超积累东南景天对重金属的耐性和积累与PCs无关，而推测GSH可在体内参与重金属解毒过程[20-21]。
关于PCs的合成机制同样存在争议。研究证明,PCs由谷胱甘肽(GSH)为底物的酶促反应合成[22]。关于GSH如何生成PCs,研究者普遍赞同由γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基转肽酶,即植物螯合肽合成酶催化合成的观点。Grill等[23]通过蝇子草属(Silenecucubalis)细胞培养,以GSH为底物首次合成了PCs。但是，也有报道称PCs通常在超积累和非超积累植物的根部由Cd胁迫直接产生[18, 24]。
本文针对PCs在植物耐重金属毒害中的作用及PCs的合成机制开展研究，采用体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-HPLC-ICPMS)技术[25-26]分析超积累植物印度芥菜(Brassica Juncea)不同部位Cd的含量，考察不同Cd胁迫浓度和胁迫时间条件下镉形态的分布规律，初步探讨了胁迫浓度、胁迫时间和镉耐受性之间的关系和PCs的合成机制。
1. 实验部分
1.1 仪器及主要试剂
Agilent 7500a型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)。工作参数：射频功率1350 W；采样深度5.7 mm；Babinton型雾化器；载气流速1.10 L/min；采样模式：时间分辨；采样时间2000 s；样品提升速率1 mL/min。
Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。色谱柱：TSK-GEL G3000分离柱及TSK-GELTM PW保护柱，流速0.8 mL/min，进样量100 μL，自动进样。
水：去离子水再经Milli-Q装置纯化(电阻率>18 MΩ·cm)。
Cd标准溶液：用10 mmol/L EDTA配制1.14 mg/L的EDTA-Cd溶液，对Cd未知峰进行定量，使用时按需要逐级稀释。
流动相：配制10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液，再加入0.1 mol/L NaCl，调节pH=7.5，用0.45 μm滤膜过滤，氮气鼓泡赶干净溶解氧。
1.2 植物培养
印度芥菜种子撒在珍珠岩上，用蛭石覆盖完全。放入周转箱内，周转箱内放少量水至没过箱底，外加少量Ca(NO3)2营养液(不超5 mmol/L)。蒙上实验用纱布，置于培养箱中，温度设置为28℃。待发育出两片子叶，取出，光照下培养。待长出的子叶完全伸展开，开始补加1/4营养液。待苗茁壮，开始间苗至周转箱。周转箱内放1/4营养液，5天后换全营养液培养。以后每3天更换一次营养液。植株长成后，用不同浓度的Cd标准溶液进行刺激。
1.3 样品处理
取一定量的Cd标准溶液培养的鲜叶片和根系样品，在液氮中浸泡后，于干净的玛瑙研钵中研磨。加入1.00 g干净石英砂、5.00 mL缓冲液，将样品研磨至浆状。磨碎后转移至10 mL离心管，用Tris-HCl清洗研钵，一并转移入离心管。在4℃离心10 min，转速为10000 r/min，上层清液转移入干净离心管置于冰箱(-70℃)保存。分析前，将样品从冰柜中取出，氮气保护下解冻，0.2 μm滤膜过滤后快速用SEC-HPLC-ICPMS分析。
2. 结果与讨论
2.1 镉形态的分离与检测
用文献[25]的分析检测方法，在实际样品中检测出4种镉形态，初步推断保留时间13.5 min处为Cys-Cd，10.2 min为GSH-Cd，8.8 min为(PC)2-Cd，7.8 min为(PC)3-Cd，谱图如图 1所示。为了考察PCs的合成机制及其在镉耐受性的作用，本工作重点研究了GSH-Cd、(PC)2-Cd和(PC)3-Cd的变化规律。
2.2 胁迫浓度对镉形态的影响
分别用0.5、1、3、5、10 μg/mL镉标准溶液进行刺激后，植物体内镉形态如图 2所示。可以看出，根中镉形态含量总和与刺激浓度呈正相关，随着刺激浓度的增大，根部镉形态浓度明显增大。而在叶中，刺激浓度为3 μg/mL时，镉浓度达到最大值，之后开始下降，至10 μg/mL时反而降至最低。说明PCs只有在低浓度镉胁迫下能够提高镉耐受性。
低浓度刺激时，根部的Cd以GSH-Cd形态为主；随着刺激浓度的增加，(PC)2-Cd和(PC)3-Cd逐渐增加。而在叶部，Cd的三种形态GSH-Cd、(PC)2-Cd、(PC)3-Cd均能检出，以(PC)2-Cd为主，但随着刺激浓度的变化，三种形态均先增大后减少。说明PCs一部分是由GSH转化生成，一部分是在镉的胁迫下直接产生。
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图 2 胁迫浓度对植物体根部和叶部镉形态分布的影响Figure 2. Effect of exposure levels on Cd species in root and leaf![]()
图 3 胁迫时间对植物体根部和叶部镉形态分布的影响Figure 3. Effect of exposure time on Cd species in root and leaf2.3 胁迫时间对镉形态的影响
用相同浓度的镉溶液分别对植物连续刺激24、48、72、96 h，植物体内的镉形态分布如图 3所示。可以看出，随着刺激时间的增加，根中GSH-Cd浓度先迅速增加，72 h达到最高值，而后逐渐降低，96 h降至最低。(PC)2-Cd、(PC)3-Cd也是先迅速增加，而后缓慢降低，96 h降至最低。在叶片中，GSH-Cd、(PC)2-Cd、(PC)3-Cd浓度先迅速增加，48 h达到最高值，而后逐渐降低，96 h降至最低。
随着刺激时间的延长，叶片中GSH-Cd、(PC)2-Cd、(PC)3-Cd三种形态均能检出，但始终以(PC)2-Cd形态为主。根部也能检测出三种形态，刺激48 h、72 h时以GSH-Cd为主，但96 h时以(PC)2-Cd、(PC)3-Cd为主。同时，叶片中PCs-Cd要高于根部。
而刺激时间对Cd总量在植物不同部位的分布影响规律为：随着刺激时间增加，Cd含量持续增加，且根部远远大于叶片。PCs浓度的降低表明在植物耐镉机制中PCs起部分作用，受高浓度Cd胁迫时，其他机制可能会被激发。
3. 结语
本工作利用已建立的SEC-HPLC-ICPMS分析方法测定超积累植物印度芥菜叶片和根中的镉形态，并研究了胁迫浓度和胁迫时间对镉形态分布的影响。研究表明，植物体内镉的形态及含量与胁迫浓度和胁迫时间密切相关，且形态之间会相互转化，说明PCs在镉解毒机制中仅有短暂的作用；持续高浓度胁迫下，植物会引发其他机制来抵抗镉的毒性。也证实了PCs一部分是由GSH转化生成，一部分是在镉的胁迫下直接产生。因此认为，研究植物螯合肽在镉解毒机制中的作用需要考虑胁迫浓度和胁迫时间这两个重要参数。
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表 1 提取溶剂对稠环芳烃荧光强度的影响
Table 1 The fluorescence intensity of poly-nuclear aromatic hydrocarbons with different solvent agents
溶剂 样品 发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 正己烷 空白 1.49 3.50 0.56 4.32 0.38 4.81 2号样品 391.36 1.40 234.38 4.59 55.66 4.64 二氯甲烷 空白 12.68 2.05 16.78 2.44 9.52 2.00 2号样品 505.99 1.81 407.55 2.51 101.40 4.58 乙酸乙酯 空白 13.38 3.53 12.95 3.12 8.59 2.44 2号样品 341.04 3.90 193.09 3.56 48.03 3.61 石油醚 空白 144.96 5.02 45.15 3.06 23.08 7.71 2号样品 300.19 3.28 115.18 4.54 83.65 3.83 
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表 2 提取溶剂对低含量样品稠环芳烃荧光强度的影响
Table 2 The fluorescence intensity of low content poly-nuclear aromatic hydrocarbons with different solvent agents
溶剂 样品 发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 正己烷 空白 1.53 3.76 0.64 4.55 0.36 3.96 5号样品 10.63 2.15 8.55 3.87 4.38 4.01 二氯甲烷 空白 13.82 2.45 17.27 3.09 10.06 2.67 5号样品 14.25 3.82 18.99 2.96 12.84 3.85
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表 3 样品粒径对荧光强度的影响
Table 3 The fluorescence intensity of poly-nuclear aromatic hydrocarbons with different particle sizes
样品及其粒径 发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 0号样品(未筛分) 350.92 2.49 195.23 3.92 42.74 4.46 1号样品(0.380~0.177 mm) 378.26 1.76 224.59 3.72 50.31 4.20 2号样品(0.177~0.125 mm) 395.27 3.67 237.54 3.14 53.16 4.35 3号样品(0.125~0.090 mm) 534.98 2.82 323.05 1.18 68.65 3.85 4号样品(≤0.090 mm) 380.87 3.23 203.85 4.63 45.38 4.16
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表 4 振荡时间条件下对荧光强度的影响
Table 4 The fluorescence intensity of poly-nuclear aromatic hydrocarbons under different oscillation time
振荡时间
(min)发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 10 379.53 3.64 231.32 3.06 47.41 2.55 20 385.11 2.39 240.32 4.53 52.12 3.61 30 389.33 1.33 243.52 2.05 54.21 2.43 40 388.51 2.96 245.75 2.18 55.98 3.67
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表 5 静置时间对荧光强度值的影响
Table 5 The fluorescence intensity of poly-nuclear aromatic hydrocarbons with different standing time
静置时间
(h)发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 3 335.79 1.86 162.43 1.29 32.01 2.04 6 368.86 4.50 198.74 3.93 43.83 4.06 9 386.48 3.15 240.53 3.55 49.36 3.87 12 390.03 2.60 237.91 3.63 52.12 2.12
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表 6 提取温度条件对荧光强度的影响
Table 6 The fluorescence intensity under different temperature of sand sample
温度/℃ 发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 15 286.07 3.26 175.84 4.16 36.35 3.69 20 355.73 2.97 214.62 3.68 44.96 4.05 25 389.59 2.67 243.26 3.14 54.65 3.35
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表 7 优化条件下样品测试结果
Table 7 The fluorescence intensity under optimization conditions
溶剂 样品 发射波长320 nm 发射波长360 nm 发射波长405 nm 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 荧光强度平均值 RSD(%) 正己烷 空白 1.74 2.23 0.72 3.75 0.53 4.02 3号样品 542.13 3.15 330.24 2.67 71.40 3.26
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