汞化合物的生物化学行为和毒性与它们的化学形态密切相关，仅仅从总量来评价其安全性是不科学的。有机汞的毒性大于无机汞，其中甲基汞的毒性最强。由于甲基汞具有亲脂性、生物积累效应和生物放大效应，其毒性是无机汞的几百倍^[1]。有机汞化合物在农业中常用作杀虫剂和杀菌剂，很容易进入生物食物链^[2]，造成食品安全事件频频发生，例如2012年奶粉的汞超标事件。对于汞形态分析，应属水产品的报道较多，在这些基体中汞常以甲基汞的形态存在；而对乳粉样品的汞形态研究还未见报道。对于乳粉样品，由于基质的复杂性，乳粉中蛋白、脂肪、乳糖等有机物中所含的巯基与汞化合物的结合非常牢固，形成稳定的络合物，要将汞的各种形态从结合态中完全解离出来是汞形态分析工作的重点，同时在前处理过程中须保证各形态提取完全且各形态之间不会发生相互转化，因此，样品前处理是汞形态分析的难点。

乳粉中汞含量极低，也对汞形态分析的检出限提出了更高的要求。目前汞形态分析的方法很多，对汞形态的分离常采用色谱分离技术，如气相色谱^{[3, 4]}、高效液相色谱^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]}、离子色谱^[12]、毛细管电泳分离^{[13, 14]}等。常用的检测手段有电化学检测器(ECD)、原子吸收光谱仪(AAS)^[3]、原子荧光光谱仪(AFS)^{[5, 8, 9, 10, 15]}、电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)^{[4, 6, 7, 11, 12, 14]}等。各种分离技术均有优缺点。如采用气相色谱进行分离，在前处理过程中需要衍生化，操作较为繁琐；采用毛细管电泳分离，设备普及率不及其他的分离手段。在检测手段方面，ECD、AAS、AFS、ICP-AES的检测灵敏度均不及ICP-MS；且ICP-MS具有很高的灵敏度和很好的选择性，对于汞的分析，选择丰度比最高的202作为采集的质量数，在乳粉基质中无质谱干扰，与离子色谱联机无需特别的接口，硬件条件很容易实现。

本文建立了一种离子色谱-电感耦合等离子体质谱(IC-ICP-MS)测定乳品中汞形态的分析技术。实验室重点优化了样品的前处理方法，采用多种复合酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)对奶粉基质中的蛋白、脂肪、淀粉进行解离，以L-半胱氨酸、盐酸和甲醇的混合溶液作为提取剂进行超声提取，样品过RP固相萃取小柱去除杂质后导入Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)进行分离，流动相采用10 mmol/L乙酸铵-0.12% L-半胱氨酸-5%甲醇混合溶液进行淋洗，最后通过ICP-MS对三种汞形态(二价汞、甲基汞、乙基汞)进行定量。该方法可为乳粉中汞的富集形态研究提供数据支持。

1.   实验部分

1.1   仪器及工作条件

ICS1500型离子色谱仪(美国Thermo公司)。离子色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)；淋洗液：10 mmol/L乙酸铵-0.12%L-半胱氨酸-5%甲醇混合溶液；流速1 mL/min；进样量20 μL。

Agilent 8800电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)。同心雾化器；石英雾化室：半导体控温(2±0.1)℃；屏蔽矩。质谱仪参考条件见表 1。

表  1  ICP-MS仪器工作条件

Table  1.  Working parameters of the ICP-MS instrument

工作参数	设定条件		工作参数	设定条件
功率	1500 W		采样深度	9.5 mm
载气(Ar)流量	0.60~1.20 L/min		采集质量数	202Hg
辅助气(Ar) 流量	与载气流量的总和 保持在1.0~1.2 L/min之间		矩管	石英一体化， 2.5 mm中心通道
进样管内径	< 0.2 mm		灵敏度	> 300 Mcps/(μg/g)
采样锥	铂锥		积分时间	0.5 s

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色谱柱与ICP-MS相联的管线距离不超过0.5 m。

DMA80测汞仪(法国麦尔斯通公司)。

超纯水机(德国Merk公司)，超声波清洗器KQ-500E(昆山市超声仪器有限公司)，水浴锅(北京长安永创科学仪器有限公司)，冷冻离心机(湖南湘仪设备有限公司)。

1.2   标准溶液与主要试剂

甲基汞(76.6 μg/g)、乙基汞(75.3 μg/g)、二价汞(1000 μg/mL)标准溶液：购自中国计量科学研究院。调谐溶液：10 ng/mL锂、钴、钇、铈、铊混合标准溶液(2%硝酸介质，货号Part#5184-3566，购自美国Agilent公司)。

内标溶液：1.0 μg/mL铋标准溶液(2%硝酸介质)：购自中国计量科学研究院。

L-半胱胺酸(纯度>98%，美国Sigma公司)。

蛋白酶(活性≥400 units/mg，美国Sigma公司)，脂肪酶(活性≥700 units/mg，美国Sigma公司)；α-淀粉酶(活性300~5000 units/mg，天津市福晨化学试剂厂)。

RP固相萃取小柱(1 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

甲醇(色谱纯，百灵威公司)，硫代硫酸钠(分析纯，北京化学试剂厂)，盐酸(优级纯，北京化学试剂厂)，超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)，用于配制所有标准溶液与样品溶液。

1.3   实验方法

称取约0.5 g样品于30 mL锥形瓶中，加入约20 mL水摇匀，盖上瓶塞，加入蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶各0.06 g(或配成溶液添加)，置于37℃水浴锅中酶解14 h后，加入30 g/L的L-半胱胺酸1.0 mL、5 mol/L盐酸0.5 mL和甲醇1.25 mL振荡提取10 min。用水定容至25 mL比色管中，5000 r/min高速离心后，取上清液过RP小柱，过0.45 μm滤膜后导入C18色谱柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)进行分离，采用电感耦合等离子体质谱仪进行定量，同时准备试剂空白。

2.   结果与讨论

2.1   样品前处理方法

检测乳制品中的汞形态，样品前处理的难度大于文献中常报道的海产品和环境样品的前处理^{[3, 4, 8, 9, 11, 12, 16]}。样品中有机汞非常容易和样品中蛋白质上的巯基结合，稳定地络合在蛋白上，会随着蛋白沉淀时沉淀下来或者是与蛋白质共同吸附在分离色谱柱上，无法洗脱，无法被检测器检测。乳粉基体主要由约20%的蛋白质、约30%的脂肪和约50%的乳糖组成^{[17, 18]}。蛋白、脂肪、淀粉等物质如果不在前处理过程中去除，会对色谱柱造成不可逆转的伤害。保证汞的各种形态在蛋白沉淀的过程中不随着共沉淀而损失，同时保持形态的稳定是本研究工作的重点。

2.1.1   样品中杂质的去除

乳粉样品基质复杂，要采用色谱柱进行分离，首先需去除基质中的蛋白。乳粉样品的除蛋白方式通常有以下几种：乙腈沉淀蛋白、乙酸沉淀蛋白、等电点沉淀蛋白以及酶解沉淀的方式。乙腈沉淀蛋白体系的样品中，由于含有大量的乙腈(一般含量在60%左右)，采用ICP-MS作为检测器时，在溶剂流出的一瞬间，有机相含量太大，等离子体条件发生了较大变化，造成ICP-MS氩火焰不稳定，甚至熄灭，无法正常检测。乙酸沉淀蛋白体系虽然对于ICP-MS检测而言不存在较大的问题，但是由于现在的乳粉成分较为复杂，有些样品含有类似于增稠剂的食品添加剂等物质，采用乙酸沉降的方式很难沉淀下来，并不能适合于所有的奶粉基质。等电点沉淀蛋白体系适用于所有基质的乳粉，但是操作过程较为繁琐，需要对每个样品调其pH值，不适合大批量样品的检测。

本实验室选择酶解的方式去除杂质，对酶的用量、酶解时间进行了条件摸索。针对乳粉基质，实验室采用蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶组成的复合酶对乳粉进行酶解。复合酶的用量对酶解效果起着很重要的作用。一般而言，底物含量越高酶解的效果越好，但是酶本身也是一种蛋白质，其加入量过多也会吸附各种形态的汞，降低回收率。

在酶的用量实验中，称取约0.5 g样品于30 mL具塞三角瓶中。加入蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的含量分别由0.02 g逐级增加到0.1 g，对酶解效果进行评价。当各种酶的含量分别为0.06 g时，酶解效果较好。同时将酶解后的溶液过0.45 μm滤膜和RP小柱去除其中的蛋白，得到的样液采用测汞仪检测总汞含量得出了相同的结论。在此条件下，总汞的含量最大，酶解效果最好，汞从蛋白基质中的解离效果最好。

在酶解时间实验中，当酶解时间达到14 h以上时，酶解基本完成。一般在pH>4.5的条件下进行酶解较好，实验室测试了0.5 g乳粉溶解在约20 mL的超纯水中时pH=6.5，满足酶解的条件，无需调节pH值。酶解温度则一般选择细菌的培养温度37℃。

2.1.2   提取溶液的选择

对于汞形态分析，不同的样品基体需采用相应的提取方法，常用的提取方法有酸提法、碱提法以及超临界流体萃取等^[16]。实验室对于酸提取和碱提取两种提取方法进行了考察，样品溶液经处理用离子IC-ICP-MS进行形态分析。选择不含汞的乳粉样品在基质上加标试验，考察汞的各种形态的提取率(回收率)。

从表 2的实验结果可以看出，对于不同的汞形态，不同提取体系的提取率各不相同。采用体系② 进行提取，二价汞和甲基汞的回收率很高，而乙基汞的回收率在80%左右。当提取液中有硫代硫酸钠时，可以提高乙基汞的回收率，即采用体系① 进行提取，这时乙基汞的回收率明显增加，接近100%，但是二价汞的回收率极低，无法满足检验的要求。体系③ 是碱性体系，汞各形态的回收率均较低，显然不适合应用。综合考虑三种体系中汞形态的回收率结果，本文确定采用体系②(即0.12% L-半胱氨酸溶液+0.1 mol/L盐酸+5%甲醇)进行提取。

表  2  不同提取液对汞形态的回收率

Table  2.  The recovery rate of Hg speciation by different extraction systems

汞形态	回收率(%)
	体系①：0.12% L-半胱氨酸溶液+0.1%盐酸+0.1%硫代硫酸钠溶液+5%甲醇	体系②：0.12% L-半胱氨酸溶液+0.1 mol/L盐酸+5%甲醇	体系③：50 mmol/L氢氧化钠碱性溶液+5%甲醇
二价汞	12.1	98.5	55.3
甲基汞	100.4	102.3	44.9
乙基汞	97.6	80.6	39.4

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2.1.3   提取方式的选择

一般溶剂提取采用超声、振荡、恒温水浴等方式。由于振荡法和恒温水浴法的提取时间较长，实验室对超声提取进行了条件摸索。将酶解后的溶液加入L-半胱氨酸、盐酸和甲醇混合溶液进行萃取，萃取时间分别设定为0、5、10、20、30、40、50、60 min。从图 1可以看出10 min后提取量没有明显的变化，最终确定超声时间选择为10 min。同时在实验过程中发现，超声时间越长，乙基汞逐渐转化为二价汞，所以超声时间也不宜太长。

图  1  超声时间对提取率的影响

Figure  1.  Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of Hg speciation

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2.2   离子色谱-质谱联机检测条件

2.2.1   色谱柱和淋洗液的选择

进行汞形态分析，常用反相高效液相色谱柱作为分离手段。在反相键合色谱中，固定相的极性小于流动相的极性，适合于分离非极性、极性和离子型化合物^[16]。本实验选择C18柱作为汞形态的分离柱，选择适当的离子对试剂与汞化合物反应，生成非极性化合物在反相柱上进行分离。

实验室还考察了L-半胱氨酸、四丁基溴化铵、溴化钾体系作为离子对试剂对汞形态进行洗脱。L-半胱氨酸的洗脱能力明显强于四丁基溴化铵和溴化钾，同时L-半胱氨酸也作为一种络合剂，它的含量还会影响汞形态的峰形。当L-半胱氨酸的含量较低时，汞的各种形态的保留时间较长，峰形拖尾；当汞含量增加到一定程度时，二价汞与甲基汞的分离效果变差，峰形却越来越尖锐；然而汞含量越高，带入的盐类不仅仅是容易在ICP-MS的截取锥锥口沉积，同时对色谱柱的损伤也较为严重。当L-半胱氨酸的浓度在0.12%时，能在5 min内完成分离。

甲醇在检测过程中有着双重的作用。① 淋洗液中甲醇的加入会影响到极性，甲醇含量越大，汞的各种形态的保留时间越短；当甲醇浓度增加到10%时，二价汞与甲基汞很难实现完全的基线分离，因此要求甲醇的浓度在10%以下。② 汞元素在ICP-MS检测器上的灵敏度较低，因为汞的第一电离能为1007.1 kJ/mol，电离效率较低。因此，甲醇作为一种有机试剂，还对ICP-MS检测具有增敏效应，增敏效应产生的原因可能是电离的碳离子与部分未电离的目标离子之间发生了电荷转移效率，提高了汞的电离效率，增强了灵敏度^{[19, 20]}。但是当甲醇的含量增加到过量的程度，会使等离子体炬的参数发生较大变化，反而增加了电离的负担，灵敏度又会下降。实验数据也证明了这一点。图 2为不同的甲醇浓度条件下，10 μg/L汞溶液的灵敏度的变化。当甲醇含量约5%时，汞的灵敏度最高，这与色谱分离要求的甲醇含量在10%以下的条件相吻合，最终选择甲醇的浓度为5%。

图  2  甲醇对汞检测灵敏度的影响

Figure  2.  Effect of methanol on detection sensitivity of Hg

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对分离条件进行优化后，在5 min内能实现三种汞形态的基线分离(图 3)。

图  3  IC-ICP-MS联机检测汞的各种形态的分离色谱图(浓度以汞计均为10 μg/L)

Figure  3.  Chromatogram of mercury speciation by IC-ICP-MS

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2.2.2   质谱分析条件的选择

汞在自然界共有6个同位素，其中丰度比较高的同位素有¹⁹⁹Hg、²⁰⁰Hg、²⁰¹Hg、²⁰²Hg，丰度比分别为16.87%、23.10%、13.18%、29.86%，这些质量数分别容易受到¹⁸³W¹⁶O、¹⁸⁴W¹⁶O、¹⁸⁵Re¹⁶O、¹⁸⁶W¹⁶O等多原子离子的干扰，然而可能干扰的这些物质几乎不存在于食品基体中，所以实验室选择了丰度比最高的202作为采集的质量数，样品基质中无质谱干扰。

2.3   方法检出限和线性范围

将浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L的二价汞、甲基汞和乙基汞系列标准溶液进行了线性范围的测定，三条曲线的线性方程、相关系数见表 3。调谐仪器到最佳状态，进样量10 μL。选择汞本底值较低的试剂进行实验，保证较低的基线背景。在最终确定的仪器条件下，奶粉中的二价汞、甲基汞和乙基汞的仪器检出限分别为0.01 μg/L、0.012 μg/L、0.018 μg/L(见表 3)。对于乳粉样品如果稀释倍数是50倍时，固体样品的检出限分别为0.5 μg/kg、0.6 μg/kg、0.9 μg/kg。相关文献[7]采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)测定二价汞、甲基汞、乙基汞，本文采用的IC-ICP-MS仪器检出限与HPLC-ICP-MS方法相比较降低了一倍，达到了较好的检测水平，完全满足乳粉中痕量汞形态检测的要求。

表  3  线性方程、线性范围和仪器检出限

Table  3.  Linear equations, linear range and the detection limit of the instrument

汞形态	线性方程	相关系数 (r2)	线性范围 (μg/L)	仪器检出限 (μg/L)
二价汞	y =20512x-1268.7	1.0000	0.5~20.0	0.01
甲基汞	y =14778x-586.9	0.9998	0.5~20.0	0.012
乙基汞	y =13671x-258.4	0.9993	0.5~20.0	0.018

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2.4   加标回收率和精密度

为了考证汞的各形态的回收率情况，选择样品中汞含量低的样品进行加标回收实验。分别在样品中加入2、10、20 μg/L三个梯度的单标溶液，各溶液平行测定6次(n=6)。由表 4可以看出，无论是二价汞、甲基汞还是乙基汞，加标回收率均在79.9%~111.2%之间，精密度(RSD)在1.7%~3.2%之间，完全满足实验的要求。

表  4  方法加标回收率和精密度

Table  4.  Recovery and precision tests of the method

物质名称	加标溶液1 (2 μg/L)		加标溶液2 (10 μg/L)		加标溶液3 (20 μg/L)
	平均 回收率 (%)	RSD (%)	平均 回收率 (%)	RSD (%)	平均 回收率 (%)	RSD (%)
二价汞	105.6	2.1	91.6	3.1	95.2	2.1
甲基汞	95.6	1.7	97.5	2.2	111.2	2.0
乙基汞	79.9	2.8	84.7	3.2	87.3	3.2

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3.   实际样品分析

采集5种实际乳粉样品，用测汞仪测定乳粉的总汞含量，同时采用本工作建立的IC-ICP-MS方法分析二价汞、甲基汞、乙基汞三种汞形态，以三种汞形态的加和值与总汞检测结果相比较得到提取率，分析结果列于表 5。从实验结果可以看出，对于汞总量很低的乳粉样品，汞各形态的提取率也能达到70%以上，可以满足实验的要求。

表  5  乳粉中汞的形态分析

Table  5.  Analytical results of mercury speciation in milk powder

样品名称	测汞仪测定的 总汞含量 (mg/kg)	汞形态的测定值(mg/kg)			汞形态的 提取率 (%)
		二价汞	甲基汞 (以汞计)	乙基汞 (以汞计)
乳粉1	0.352	0.317	0.028	未检出	98.0
乳粉2	0.152	0.132	0.015	未检出	96.7
乳粉3	0.036	0.034	未检出	未检出	94.4
乳粉4	0.019	0.011	0.003	未检出	73.6
乳粉5	0.025	0.021	未检出	未检出	84.0
鱼肉标准物质 (GBW 10029)	0.86 (标准值0.85)	未检出	0.85 (标准值0.84)	未检出	98.8

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采用本工作建立的IC-ICP-MS方法对鱼肉国家标准物质(GBW 10029) 进行测定，总汞与甲基汞的含量与相应的标准值吻合，证明该方法准确可靠(表 5)。图 4为某汞含量高的乳粉的色谱分离图，可以看出奶粉中汞的富集形态主要是二价汞和甲基汞。

图  4  乳粉样品中汞形态的色谱分离图

Figure  4.  Chromatogram of Hg speciation in milk powder

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4.   结语

乳粉的汞形态分析存在一些难点，如由于基质的复杂性造成提取率低、乳粉中汞含量极低对方法检出限提出了更高的要求，本文建立的离子色谱-电感耦合等离子体质谱方法解决了这些难点问题。该方法前处理过程中采用酶解的方式解离复杂基体中的汞形态，提高了提取率，仪器检测条件方面采用甲醇作为增敏剂，提高了检测灵敏度，方法检出限低。

本方法可以应用于乳粉样品的实际检测工作。而针对乙基汞的加标回收率(75%~90%)较低的问题，有待于进一步优化实验条件，提高乙基汞的检测能力。