Study on Accelerated Solvent Extraction of Free Fatty Acids in Marine Sediments
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摘要: 脂肪酸是沉积物中含量最丰富的脂类标记物之一, 其存在形式主要有游离态脂肪酸和结合态脂肪酸。游离态脂肪酸可由溶剂直接提取, 结合态脂肪酸是在已提取出游离态脂肪酸的沉积物残渣中加入酸碱加热后再用溶剂提取。加速溶剂萃取技术(ASE)因成本低和操作毒性小, 在脂肪酸研究中得到了广泛的应用。本文采集东海近海海域沉积物作为研究样本, 由于其中游离态脂肪酸含量丰富, 而结合态脂肪酸含量过低, 测定结果精密度差, 难以作为方法研究对象, 因此主要针对游离态脂肪酸应用加速溶剂萃取法进行提取, 研究了各种实验条件, 包括萃取剂、萃取温度、静态萃取时间和循环次数的选择与优化。分析结果表明, 甲醇-二氯甲烷(V:V, 1:3) 更适合作为萃取剂; 随着萃取温度、静态萃取时间、循环次数的增加, 不同类型脂肪酸的提取效率各不相同, 以涵盖碳原子数最多为先决条件, 以脂肪酸的萃取效率最大化为依据, 确定了加速溶剂萃取的实验条件是:萃取温度110℃, 静态提取时间10 min, 循环3次。用这种处理方法5次测定沉积物样品中游离态脂肪酸的精密度为3.3%~19.0%, 其替代物回收率为72.2%~104.6%。该方法应用于分析实际海洋沉积物样品, 相比于传统的索氏提取法, 流程简单, 极大地提高了工作效率。Abstract: Fatty acids are one of the most abundant lipid markers in marine sediments, whose primary occurrence forms are free fatty acids and conjugated fatty acid. Free fatty acid can be extracted directly by solvent, and conjugated fatty acid is extracted from leftover sediment residue after free fatty acid has been extracted, through adding acid or alkali, and then extracting after being heated. Accelerated solven extraction (ASE) is a very popular method in the study of fatty acids due to its low cost and low toxicity. In this study, coastal sediments were collected from the East China Sea. Conjugated fatty acid is not suitable for verifying the method due to its low concentration and large uncertainty; therefore, the determination of free fatty acid in marine sediments by gas chromatography mass spectrometry with ASE for sample pretreatment is discussed in this paper. The main factors which affect the extraction yield of fatty acid by ASE, such as the proportion of extractants, the temperature, static extraction time and cycle times are discussed and optimized. The following conclusions were reached: methanol-methylene chloride (V:V=1:3) is more suitable to be the extractant. The extraction efficiency of different types of fatty acids varies with increasing temperature, static extraction time and cycle times. Based on increasing carbons being extracted and the highest extraction efficiency, the optimum parameters for fatty acid extraction from marine sediments are: extraction temperature of 110℃, static time of 10 min and 3 cycles. The precisions of this method were 3% to 23% RSD, and the recovery rates were from 72.2% to 104.6%. This method is applicable to the quantitative analysis of alcohols and ketones in marine sediment, which is an improvement on conventional soxhlet extraction with less reagent consumption, good precision and is a simple procedure.
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土壤中的As、Hg是有毒有害元素，通过食物链进入人体后危害很大，国家环保部发布的土壤环境监测技术规范中将As和Hg列为重点监测项目[1]。它们在土壤中往往以痕量水平存在，测定这些痕量元素的方法有很多，通常采用化学法[2]和氢化物发生-原子荧光光谱法[3-5]来测量，氢化物发生-原子吸收光谱法测量也偶见报道[6-7]。化学法因测量过程繁琐，方法灵敏度不高，多元素测量时存在测量周期长、试剂消耗多等问题[8]，氢化物发生-原子荧光光谱法或原子吸收光谱法亦属单元素测量，普遍存在着As和Hg需要分别测试的问题，无法实现多元素同时测量的效果[9-11]。电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)因其具有多元素同时测定、较高的灵敏度和分析精密度而得到广泛应用，将氢化物发生与ICP-AES联用，测定诸如水[12-13]、食品[14]、药品[15]、地质样品[16-17]、金属合金[18]等样品中元素含量是近年来分析领域新的研究方向，但也未见将As、Sb、Bi、Hg四种元素在同溶液同条件下同时测量的报道。
本文提出将土壤样品在沸水浴中用50%的王水处理后，加入一定量50 g/L的抗坏血酸和硫脲溶液，然后将龚治湘教授自行研制的微型化学原子化器[19-20]与ICP-AES连接，通过优化载气流量、进液量、介质酸度和NaHB4浓度等测量条件，在同一条件下同时测定了As、Sb、Bi、Hg四种元素，建立了一种一次溶样即可实现多元素同母液同条件下同时测定的方法。
1. 实验部分
1.1 仪器与工作条件
iCAP 6300电感耦合等离子体发射光谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)。仪器工作条件为：功率1150 W，蠕动泵转速75 r/min，辅助气流量1.0 L/min，雾化气流量0.5 L/min(转子流量计测量)，冲洗时间25 s，积分时间15 s，用水平观测方式测量。各元素的测量波长为：砷193.7 nm，锑206.8 nm，铋223.1 nm，汞184.9 nm。
微型化学原子化器(MCA-E401，专利号ZL200420084256.7)。
1.2 标准溶液和主要试剂
砷、锑、铋混合标准溶液：由高含量的砷、锑、铋国家混合标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)逐级稀释成标准工作溶液，使用时保持10%的盐酸酸度，并加适量50 g/L硫脲和50 g/L抗坏血酸混合液来预先还原。
汞标准溶液：由高含量的汞国家标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)逐级稀释成标准工作溶液。使用时保持4%的盐酸酸度。或者与As、Sb、Bi一同配制成混合溶液，在10%盐酸中进行测定。
硼氢化钠-氢氧化钠溶液(10 g/L)：称取1.0 g硼氢化钠和1.0 g 氢氧化钠，溶于100 mL去离子水中。
预还原液(50 g/L)：称取5.0 g硫脲和5.0 g抗坏血酸，溶于100 mL去离子水中。
实验所用试剂均为优级纯，实验用水为去离子水，所用玻璃仪器均需20%硝酸浸泡24 h。
1.3 实验方法
称取0.5~1.0000 g干燥的土壤样品于50 mL比色管中，加入10 mL 50%的王水，摇匀，盖塞放置于水浴中分解1 h(采用电炉烧杯水浴)，其间开盖摇散样品数次，冷却后定容至25 mL，待澄清后分取一定量的上层清液，加入适量的预还原剂还原半小时以上，上机测定。随样品同时制备三个试剂空白。
2. 结果与讨论
2.1 载气流量的选择
ICP-AES工作时载气流量范围为0.4~1.0 L/min，用20 μg/L的Hg或As、Sb、Bi混合标准溶液，在0.4~1.0 L/min氩气流量下进行试验。图 1的结果显示随着氩气流量的增大，信号强度值逐渐减小；但当使用0.4 L/min流量时焰炬出现闪动现象，信号值不稳定，故采用0.5 L/min的载气流量进行试验。
2.2 蠕动泵转速的选择
试液的进液量对测量有一定影响，进液量小产生的氢化物少，影响灵敏度，过多又影响等离子体的稳定性。蠕动泵转速用25、50、75和100 r/min试验，以75 r/min较好，此时的进液量约为2.5 mL/min。
2.3 样品分解方法的选择
As、Sb、Bi、Hg属于易挥发元素，高温下易挥发损失。本法采用电炉烧杯水浴比色管溶解法有几方面原因：一是水浴溶解比直接使用烧杯在电热板上溶解反应平缓，不会蒸干溶液，减少元素的损失；二是电炉加热可以使水浴很快沸腾并且一直保持沸腾状态，溶解1 h即可达到要求。试验中发现两种水浴法对Hg的测定影响不大，但对As、Sb、Bi而言水浴锅溶解的样品测定值只有标准值的70%左右，原因可能在于水浴锅中的水不是沸腾状态；三是可以实现在同一比色管中溶样、定容、分取等操作，减少溶液转移带来的误差，提高准确度，使溶样更简便。
2.4 砷和锑价态的还原
As和Sb价态的不同，灵敏度之间有很大差异，As和Sb需要用50 g/L硫脲和50 g/L抗坏血酸混合液来预先还原为+3价，每10 mL样品溶液加1 mL还原液，还原时间至少为30 min，可以让其充分还原。
2.5 还原剂对汞测定的影响
Hg标准溶液可与As、Sb、Bi一同配制成混合标准液，加入预还原液30 min后进行测定，此时Hg会还原成基态原子。本文试验了Hg标准溶液在加入还原液还原后的情况，与不加还原液时的信号强度进行比较，表 1结果显示Hg在有无还原剂的情况下测定强度基本一致，可以与As、Sb、Bi在相同的条件下多元素同时进行分析。
表 1 还原剂对Hg测定的影响Table 1. Effect of reductant on Hg determination汞标准溶液的浓度
ρ(Hg)/(μg·L-1)Hg的测定强度/(Cts·S-1) 不加还原剂 加还原剂 4.0 1121 1127 10.0 2660 2680 20.0 5115 5097 100.0 26182 26208 2.6 介质酸度的选择
As、Sb、Bi等元素在酸性介质中可以与强还原剂硼氢化钠生成易原子化的氢化物气体，Hg离子被还原成基态原子Hg。用不同盐酸酸度的标准溶液试验，结果表明，Hg对酸度的要求不很严格，而As、Sb、Bi需要10%以上的酸度，试验选用10%的盐酸酸度。
2.7 硼氢化钠浓度的选择
取20 μg/L的As、Sb、Bi混合标准溶液或20 μg/L的Hg标准溶液，试验了5.0~15.0 g/L的硼氢化钠溶液，表 2结果显示硼氢化钠在浓度为10.0 g/L时信号值最大。硼氢化钠浓度过高时会产生大量气体，致使焰炬不稳定，故实验中硼氢化钠浓度均采用10 g/L。
表 2 NaHB4浓度的影响Table 2. Effect of NaHB4 concentration元素的测定强度/
(Cts·S-1)ρ(NaHB4)/(g·L-1) 5.0 10.0 15.0 Hg 5080 5425 4954 As 1353 1572 1282 Sb 2112 2326 1740 Bi 1397 1489 1172 2.8 标准曲线与方法检出限
在50 mL容量瓶中用As、Sb、Bi混合标准溶液配制成0、5.0、20.0 μg/L的标准系列，保持10%的盐酸酸度，并加5 mL还原液预先还原30 min以上。同样在50 mL容量瓶中配制0、4.0、20.0 μg/L的Hg标准系列，保持4%的盐酸酸度，也可以与As、Sb、Bi在10%盐酸中同时测定。在所选定仪器工作条件下绘制标准曲线，得到Hg、As、Sb、Bi的线性回归方程分别为：A=301.43ρ+26.119，A=80.337ρ+52.892，A=76.962ρ+45.854，A=104.96ρ+14.581，相关系数均在0.999以上。
制备11个试剂空白溶液上机分别测定，以3倍标准偏差除以标准曲线斜率计算检出限，得到的检出限：Hg为0.01 ng/g，As为0.06 ng/g，Sb为0.04 ng/g，Bi为0.01 ng/g，满足规范测量要求[21]。
3. 标准物质和实际样品分析
按照1.3节实验方法对国家标准物质GBW 07402、GBW 07404、GBW 07408、GBW 07104、GBW 07111进行了测定，表 3数据显示分析结果的准确度和相对标准偏差都满足要求，方法精密度低于5%，证明了方法的适用性。
表 3 地质标准样品分析结果Table 3. Analytical results of elements in National Standard Reference Materials标准物质编号 分析元素 wB/(μg·g-1) 准确度RE/% RSD/%
(n=4)标准值 测定值 GBW 07402 As 13.70 13.43 98.0 1.53 Sb 1.30 1.25 96.2 1.04 Bi 0.38 0.36 94.7 2.33 Hg 0.015 0.014 94.0 4.28 GBW 07404 As 58.00 62.05 107.0 2.13 Sb 6.30 6.39 101.4 1.96 Bi 1.04 1.06 101.9 1.22 Hg 0.59 0.61 103.4 2.09 GBW 07408 As 12.70 12.30 96.8 3.40 Sb 1.00 0.99 99.0 0.82 Bi 0.30 0.28 93.3 3.38 Hg 0.017 0.015 88.2 3.28 GBW 07104 As 2.10 1.92 91.4 3.43 Sb 0.12 0.11 91.7 4.62 Bi 0.081 0.079 97.5 2.17 Hg 0.012 0.011 91.7 4.11 GBW 07111 As 0.40 0.37 92.5 4.64 Sb 1.34 1.31 97.8 0.98 Bi 0.05 0.05 100.0 2.66 Hg 0.035 0.032 91.4 3.97 应用此法检测了客户提供的鲫鱼肉和肝中Hg和As的含量，鱼肉和鱼肝经硝酸和高氯酸消解后[22]按照仪器试验条件进行测定，并进行了加标回收试验，加标回收率为92.0%~102.0%(见表 4)。
表 4 实际样品分析结果Table 4. Analytical results of elements in real samples实际样品 分析元素 wB/(μg·g-1) 回收率/% 测定值 加标量 测得总量 鲫鱼肉 As 0.108 0.100 0.202 94.0 Hg 0.069 0.100 0.171 102.0 鲫鱼肝 As 0.065 0.100 0.160 95.0 Hg 0.027 0.050 0.073 92.0 4. 结语
As、Sb、Bi、Hg属于微量易挥发元素，在前处理上要特别注意样品的损失，在沸水浴中用同一比色管进行分解和定容是较为理想的选择，既操作简单又可以减少溶液转移带来的样品损失。本文将龚治湘教授自行研制的微型化学原子化器与ICP-AES连接，通过优化雾化器流量和NaHB4浓度等条件可以很好地测量10-10量级的As、Sb、Bi、Hg，实现了在同一测量条件下一次溶矿As、Sb、Bi、Hg多元素同母液同时测定的效果。方法灵敏度高、精密度好，无基体效应和记忆效应的影响，操作简单快速，测量时间短，试剂消耗量少，成本低，非常适合环境介质、食品等样品中上述痕量元素的分析。
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图 1 不同溶剂对脂肪酸提取效率的影响
(a)—萃取溶剂对不同类型脂肪酸的提取效率；(b)—萃取溶剂对单体脂肪酸的提取效率。
Figure 1. Effect of solvent on extraction efficiency of fatty acids
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图 2 不同萃取温度对脂肪酸提取效率的影响
(a)—温度对不同类型脂肪酸的提取效率；(b)—温度对单体脂肪酸的提取效率。
Figure 2. Effect of temperature on extraction efficiency of fatty acids
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图 3 不同静态萃取时间对脂肪酸提取效率的影响
(a)—静态萃取时间对不同类型脂肪酸的提取效率；(b)—静态萃取时间对单体脂肪酸的提取效率。
Figure 3. Effect of static time on extraction efficiency of fatty acids
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图 4 不同循环次数对脂肪酸提取效率的影响
(a)—循环次数对不同类型脂肪酸的提取效率；(b)—循环次数对单体脂肪酸的提取效率。
Figure 4. Effect of cycles on extraction efficiency of fatty acids
表 1 方法精密度
Table 1 Precision tests of the method
组分 脂肪酸含量(μg/g) RSD
(%)1 2 3 4 5 平均值 C12:0 0.281 0.260 0.362 0.310 0.391 0.321 17.0 a-C13:0 0.063 0.051 0.072 0.085 0.078 0.070 19.0 C13:0 0.105 0.096 0.122 0.127 0.133 0.117 13.3 i-C14:0 0.225 0.201 0.234 0.261 0.245 0.233 9.7 C14:0 2.362 2.280 2.219 2.388 2.401 2.330 3.3 i-C15:0 1.210 1.058 1.180 1.050 1.197 1.139 6.9 a-C15:0 0.906 0.891 0.917 1.000 1.009 0.944 5.9 C15:0 1.109 1.100 1.116 1.163 1.223 1.142 4.5 i-C16:0 0.424 0.399 0.414 0.399 0.445 0.416 4.7 C16:1(n-7) 0.390 0.391 0.489 0.539 0.482 0.458 14.4 C16:0 8.065 6.089 6.875 6.536 6.545 6.822 11.0 i-C17:0 0.294 0.235 0.246 0.263 0.266 0.261 8.6 a-C17:0 0.304 0.284 0.283 0.274 0.313 0.292 5.7 C17:0 0.448 0.479 0.458 0.441 0.500 0.465 5.2 C18:1(n-7) 0.765 0.721 0.877 0.987 0.867 0.844 12.3 C18:1(n-5) 0.303 0.275 0.292 0.286 0.310 0.293 4.7 C18:0 4.005 3.587 4.370 4.509 3.707 4.036 10.0 C20:0 0.531 0.494 0.520 0.434 0.499 0.496 7.6 C21:0 0.070 0.078 0.083 0.088 0.087 0.081 9.3 C22:1(n-9) 0.193 0.186 0.172 0.191 0.199 0.188 5.3 C22:0 0.450 0.471 0.459 0.376 0.461 0.443 8.7 C23:0 0.078 0.100 0.093 0.095 0.095 0.092 9.3 C24:0 0.383 0.387 0.381 0.291 0.392 0.367 11.6 C25:0 0.043 0.065 0.052 0.056 0.059 0.055 14.9 C26:0 0.160 0.165 0.169 0.189 0.234 0.183 16.5 C27:0 0.029 0.021 0.024 0.029 0.032 0.027 16.2 C28:0 0.063 0.074 0.077 0.103 0.106 0.085 22.6 C30:0 0.017 0.024 0.025 0.016 0.027 0.022 23.3 回收率(%) 104.6 72.2 101.4 91.9 84.4 90.8 - 
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表 2 实际样品中脂肪酸的分析
Table 2 Analytical results of n-alkanes in samples
组分 黄海海洋沉积物(μg/g) 东海海洋沉积物(μg/g) 样品1 样品2 样品3 样品1 样品2 样品3 C12:0 0.20 0.26 0.22 0.10 0.34 0.74 a-C13:0 0.02 0.03 0.02 0.01 0.06 0.13 C13:0 0.09 0.10 0.08 0.05 0.13 0.25 i-C14:0 0.15 0.15 0.11 0.07 0.26 0.38 C14:0 0.74 0.87 0.72 0.98 2.39 2.23 i-C15:0 0.12 0.15 0.15 0.29 1.28 1.37 a-C15:0 0.17 0.18 0.16 0.21 0.97 1.02 C15:0 0.38 0.43 0.31 0.56 1.23 1.36 i-C16:0 0.18 0.20 0.14 0.12 0.46 0.54 C16:1(n-7) 0.16 0.13 0.05 0.19 0.47 0.69 C16:0 2.87 3.86 4.06 5.94 6.60 5.55 i-C17:0 0.05 0.06 0.08 0.07 0.27 0.46 a-C17:0 0.04 0.05 0.06 0.09 0.33 0.38 C17:0 0.24 0.28 0.20 0.25 0.56 0.71 C18:1(n-7) 0.12 0.17 0.13 0.86 0.88 0.75 C18:1(n-5) 0.07 0.12 0.16 0.16 0.32 0.40 C18:0 1.39 1.92 2.69 4.41 4.05 3.84 C20:0 0.34 0.38 0.36 0.35 0.56 0.73 C21:0 0.10 0.10 0.08 0.04 0.09 0.17 C22:1(n-9) 0.04 0.06 0.53 0.49 0.20 0.25 C22:0 0.36 0.38 0.06 0.04 0.49 0.77 C23:0 0.10 0.08 0.36 0.06 0.10 0.21 C24:0 0.36 0.29 0.07 0.37 0.40 0.81 C25:0 0.09 0.05 0.30 0.05 0.05 0.16 C26:0 0.35 0.05 0.06 0.23 0.16 0.52 C27:0 0.06 0.20 0.25 0.03 0.02 0.11 C28:0 0.18 0.08 0.12 0.13 0.07 0.37 C30:0 0.06 0.03 0.02 0.05 0.02 0.20
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