苯并(a)芘是一种强致癌物质^[1]，在2005年我国启动的全国地下水调查评价项目中已被列为半挥发性有机污染物必测组分之一^[2]。苯并(e)芘是苯并(a)芘的同系物，具有潜在的致癌性，欧盟理事会第76/769/EEC号指令中已有限量规定^[3]。目前地下水中苯并(a)芘的预富集方法主要有固相萃取、液液萃取等^[4-9]，对苯并(e)芘的研究报道还较少。双水相萃取(ATPE)是一种近年来迅速发展的绿色、高效萃取技术，具有萃取条件温和、易于操作和环境友好等优点^[10-11]，已广泛应用于生物、药物和金属分离等领域^[12-17]，在分析测试领域也有广泛的应用^[18-20]。

本文采用乙腈为萃取剂，通过对无机盐的选择，研究了双水相的形成条件，经优化实验参数实现了高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)对地下水中苯并(a)芘和苯并(e)芘的测定。通过与液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)方法比较，该方法在样品制备过程中快速简单,使用设备较少，可避免电力使用，萃取富集高效、简便，具备在野外实现原地样品前处理的实际应用潜力。

1.   实验部分

1.1   仪器及工作条件

1200S型高压液相色谱仪(美国Agilent公司，配荧光检测器)。工作条件为：以甲醇-水为流动相(体积比85:15)，流量为1.00 mL/min，保持15 min，进样量20 μL。荧光检测器激发波长为290 nm，发射波长为430 nm。ZORBAX Eclipse色谱柱(C₁₈，150 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2   标准和主要试剂

苯并(a)芘标准物质(美国AccuStandard公司，甲醇介质，浓度为100 μg/mL)；苯并(e)芘标准物质(德国Dr. Ehrenstorfer公司，乙腈介质，浓度为100 μg/mL)。

标准溶液的配制：苯并(a)芘、苯并(e)芘用乙腈配制成浓度为2.0 μg/mL的单一标准储备溶液。

乙腈、甲醇(HPLC级，百灵威科技有限公司)。

硫酸铵(分析纯，天津市天大化工实验厂)；氯化钠(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)。

1.3   实验方法

取40.0 mL水样于50 mL具塞试管中，加3.0 mL乙腈，混匀，加17.0 g硫酸铵振荡，待乙腈析出后静置5 min，取上层乙腈相(约2 mL)上机测定。

2.   结果与讨论

2.1   萃取剂的选择

能形成双水相的溶剂有甲醇、丙酮、聚乙二醇、乙腈等^{[10, 18-20]}，本文考虑乙腈可使水体中的动植物蛋白变性而使与之结合的目标化合物进一步分离、释放^{[11, 14-16]}，同时由于乙腈毒性较低且无需换相可直接进样，故采用乙腈作为萃取剂。

2.2   双水相体系中无机盐的选择

双水相的形成是由溶剂和无机盐对水分子竞争夺取程度不同造成的，实验研究了磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、碳酸钾、碳酸钠和硫酸铵等6种盐的相分离效果。结果显示，氯化钾、氯化钠、碳酸钾、硫酸铵这4种盐均能与乙腈形成乙腈-无机盐-水双水相，其他2种盐不能形成双水相。为得到最好的相分离、最高的萃取率，分别对4种乙腈-水-盐形成的双水相体系进行了优化。实验表明，在乙腈-水混合溶液中加入硫酸铵能形成稳定的双水相体系。在参考文献[21-22]方法基础上，研究了不同质量的硫酸铵对40 mL水与3.0 mL乙腈混合溶液的双水相分离及萃取率情况。图 1a表明，析出乙腈体积随加入硫酸铵质量的增加而增多，在加入17.0 g硫酸铵后溶液接近饱和，析出乙腈体积基本稳定在2.1 mL左右，乙腈含量趋于稳定且最低。图 1b表明，此时萃取率达到最高。

图  1  硫酸铵加入质量与(a)析出乙腈体积和(b)萃取率的影响

Figure  1.  Effect of (NH₄)₂SO₄ dosage on (a) acetonitrile volume and (b) extraction efficiency

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2.3   pH值对析出乙腈体积的影响

硫酸铵的加入会改变水体的pH值，本文考察了pH值对乙腈-硫酸铵-水双水相体系中乙腈相体积的影响。用磷酸调节pH值为6.0、5.0、4.5、3.5、1.6，图 2结果表明pH值在3.5~6.0时，乙腈析出体积变化为2.10~2.15 mL，最大相对偏差为2.47%，相对标准偏差(RSD，n=5)为1.34%，体系的pH值对析出的乙腈体积影响小于2.5%。

图  2  pH值对析出乙腈体积的影响

Figure  2.  Effect of pH on acetonitrile volume

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2.4   体系静置时间和离子强度的影响

本实验中，体系静置时间是指从硫酸铵加入体系乙腈析出开始直至取乙腈相进行分析为止。本文考察了静置时间为5 min、10 min、30 min、2 h、24 h对萃取率的影响。图 3显示，静置时间对萃取率没有明显的影响，可见双水相体系分相后，苯并(a)芘和苯并(e)芘在两相间的萃取平衡已经稳定，与静置时间无关。

图  3  静置时间对萃取率的影响

Figure  3.  Effect of standing time on extraction efficiency

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通常，增加水相的离子强度可能降低分析物在水相中的溶解度从而提高萃取率，但同时也会影响乙腈的析出体积，进而影响方法的精密度和准确度。本文考察了氯化钠加入水平在0~50 g/L范围内对萃取率及乙腈析出体积的影响。图 4结果表明，盐的加入对本实验的萃取率没有显著影响，原因可能是由于苯并(a)芘和苯并(e)芘在乙腈中的溶解度较大，萃取过程受水相中离子强度的影响较小。图 5表明，氯化钠加入量为0~5%时析出乙腈体积相对标准偏差(RSD，n=5)小于0.47%，对测定无明显影响。

图  4  离子强度对析出乙腈体积的影响

Figure  4.  Effect of ionic strength on extraction efficiency

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图  5  离子强度对萃取率的影响

Figure  5.  Effect of ionic strength on acetonitrile volume

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2.5   方法的线性范围、检出限和精密度

用乙腈配制浓度为2.00、8.00、20.00、60.00、120.00、200.00、400.00 ng/mL的校准点，以化合物浓度为横坐标，响应值为纵坐标绘制标准曲线，各化合物标准曲线的相关系数(R²)均大于0.999。以3倍信噪比(S/N)对应的样品浓度为方法出限，检出限为0.012~0.020 ng/mL。为了考察方法的精密度，采用空白水样加标进行5次试验。由表 1可知：在实验条件下平均加标回收率为94.6%~97.3%，精密度(RSD)为1.3%~2.5%。

表  1  方法精密度和准确度

Table  1.  Precision and accuracy tests of the method

化合物	ρB/(ng·mL-1)						平均回收率/%	RSD/%
	添加 浓度	本法分次测定值
苯并(a)芘	20.00	19.21	18.57	18.32	19.46	19.01	94.6	2.6
	60.00	56.22	57.37	59.24	58.79	57.71	96.4	2.1
苯并(e)芘	20.00	19.03	18.96	19.21	19.67	19.03	95.9	1.5
	60.00	57.35	58.26	59.33	58.22	58.87	97.3	1.3

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2.6   方法比较

比较了本方法与其他萃取技术测定苯并(a)芘的部分指数^{[4-8, 23-24]}，表 2可以看出几种方法均有回收率较高、检出限低等特点。由于固相萃取、液液萃取方式采用了大体积取样因而获得了较高的富集倍数，在这一过程中液液萃取方式使用的有机溶剂量较多，固相萃取方式操作条件比较严格，两种方式均有浓缩换相过程，因而前处理时间一般较长。本法避免了以上操作，流程简化，提高了样品处理速度，但在富集倍数方面有待提高。

表  2  几种萃取技术测定苯并(a)芘的比较

Table  2.  Comparison of extraction techniques for determination of benzo(a)pyrene

萃取方法	萃取剂 用量V/mL	萃取时间 t/min	浓缩 换相	检出限/ (ng·mL-1)	回收率/%	富集倍数
LLE-HPLC-FLD	约100	约几十	是	0.002	94~99	约1000倍
SPE-GC-FID	约几十	约几十	是	0.006	92~96	约100倍
ATPE-HPLC-FLD	约几	约几	否	0.012	94~96	近100倍

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3.   结语

建立的乙腈-硫酸铵-水双水相体系萃取-高效液相色谱测定地下水中苯并(a)芘和苯并(e)芘的方法，由于采用了乙腈-水双水相萃取技术，使提取更为环保、高效，与传统的液液萃取、固相萃取相比避免了浓缩萃取液、换相等步骤，使操作更为快捷、简便。本方法可实现对野外环境水样进行原地样品前处理，提高了分析效率，可用于地下水中苯并(a)芘和苯并(e)芘的测定。