Microbial Ecological Diversity Characteristics of the Soil Profile in the Vadose Zone Polluted by Ammonia Nitrogen
-
摘要: 包气带土壤中氨氮污染迁移规律已成为近年来国内外学者研究的重点，目前在氨氮污染迁移规律研究中采用柱实验模拟以及软件模拟的方法较多，土壤生物技术则广泛应用于污染物降解领域，而在污染物迁移规律研究中应用较少。本文采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、16S rRNA序列分析技术以及典范对应分析相结合，对华北平原3个典型氨氮污染区土壤表层至包气带剖面微环境的细菌垂直分布特征及群落结构进行研究。结合污染区土壤理化性质分析，认为包气带土壤剖面的细菌群落中存在着与氮循环、硫酸盐代谢等过程偶联的优势细菌类群，说明土壤微环境中细菌群落分布明显受氨态氮、硝态氮、亚硝态氮和硫酸盐的分布影响，进一步表明污染土壤优势菌群的群落结构信息是描述包气带土壤环境氨氮污染物迁移规律的重要参数。Abstract: Scholars at home and abroad in recent years have focused on researching ammonia nitrogen pollution migration rules in the vadose zone soil. Column simulation and software simulation were primarily conducted for the study of ammonia nitrogen pollution migration. Biotechnology was widely used in degradation of pollutant in soil, but less applied to the study of pollution migration. This study applied Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and the sequence analysis of the V3 Region of 16S rRNA combined with canonical correspondence analysis to characterize the bacteria vertical distribution characteristics and bacterial community structure in the soil from three typical contaminated zones in the North China Plain. According to the analysis of physical and chemical soil properties in polluted areas, there were some dominant individual bacteria in the key pathways of the nitrogen cycle and sulfate metabolism. It is suggested that the bacterial communities are affected by the distributions of ammonia, nitrate and nitrite nitrogen, showing that the community structure information of the dominant population in contaminated soil is an important parameter to study the ammonia nitrogen pollution migration rules.
-
激光拉曼光谱分析作为一种非破坏性的分析方法，可以快速方便地对单个包裹体进行定性、半定量分析，现已成为流体包裹体研究的基本工具之一[1, 2]。近年来随着仪器精度的提高以及科研的需要，激光拉曼针对包裹体的定量分析的研究发展迅速。定量分析主要涉及包裹体的气[3, 4, 5, 6, 7]、液相[8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]以及同位素[16, 17, 18, 19, 20]等化学组成分析以及包裹体的内压[21, 22, 23, 24]、密度[25, 26]、有机质热成熟度[27, 28]等物理参数的获取。而作为包裹体重要成分的各种无机和有机气相组分，由于其一般具有较强的拉曼活性，在拉曼谱图上表现出尖锐而特征的谱峰，因此被认为是进行拉曼定量分析的重要研究对象[29]。国内外学者对包裹体中常见的C-H-O-N-S体系的气相组分开展了比较广泛的定量研究[3, 4, 5, 6, 7]，取得了显著的成果。由于气相组分的拉曼定量分析与分子性质、温度、压力、仪器性能等诸多因素有关[3, 4, 29]，造成前人结果存在比较明显的差异，难以相互借用，如李维华等[5]与Wopenka等[30]测定的SO2的定量因子有近5倍的差别。因此在进行气相成分的定量分析之前，需要利用一系列混合气体标样对仪器进行标定。前人一般使用商用钢瓶装混合气进行仪器标定[3, 4, 5]，虽然上述标样易于购置、配比准确，却存在气体组成单一无法调节、费用高、需要经常更换钢瓶等缺点。如按10%的梯度对10%~90%的两种气体的混合物进行标定，需要购置9瓶钢瓶气轮换使用，并且钢瓶气一定的使用期限，超过期限需要重新购置。针对上述不足，本文提出了一种在线配置不同浓度和压力条件下混合气体标样的方法，以实现快速准确地对激光拉曼探针进行标定及测定气体拉曼定量因子的研究目的。
1. 在线标样制备装置和在线标样的制备
为了实现混合气体标样的制备，本次研究搭建了一套在线标样制备装置(图 1)。该装置可以同时接入三路钢瓶气体，每路钢瓶气分别连接一个减压阀用于控制气体的输出压力；利用带有刻度和活塞的体积转移器量取实验所需体积的气体并将量取的气体注入高压容器中进行混合；增压泵用于对高压容器中的混合气体进行增压；真空泵用于对装置进行抽真空；装置的输出端与石英毛细管相连接；管路中安装有真空表以及压力表用于监控系统的真空度以及线路中气体的压力值；线路中还设有两个排气孔用于排气及管路清洗。
实验所用的钢瓶气为高纯气体，浓度≥99.999%；毛细管规格为内径0.1 mm，外径0.3 mm，表面涂有一层聚酰亚胺保护膜，厚度约0.025 mm(美国Polymicro Technologies公司)。激光拉曼分析的仪器为Renishaw Invia型激光拉曼光谱仪(英国Renishaw公司)，使用Ar+激光器，波长为514 nm，光谱分辨率为2 cm-1。
在线混合气体标样制备的实验步骤如下。
(1) 打开阀门1~6、8、10，关闭阀门7、9、11，打开真空泵对管路、体积转移器及高压容器抽真空，待真空表读数≤10Pa时，关闭真空泵。
(2) 关闭阀门2~4、6、8、10，打开气瓶1的减压阀并调节至实验所需压力值，用体积转移器量取实验所需气体体积。
(3) 关闭阀门1、5、气瓶1的减压阀，打开阀门6、8，将体积转移器中的气体转移至高压容器中。
(4) 关闭阀门8，打开阀门1~6、8、10，对系统抽真空，待真空表读数≤10Pa时，关闭真空泵。
(5) 重复步骤(2)~(4)，量取实验所需体积及压力条件下的气体2并注入到高压容器中，使气体1和2充分混合。
(6) 关闭阀门6，打开阀门8、11，利用高压容器中的混合气体对管路进行清洗。
(7) 关闭阀门11，打开阀门9，打开电动增压泵，对高压容器中的气体进行增压，待达到实验所需的气体压力时，停止增压并进行激光拉曼分析，然后继续增压至下一个压力点并进行拉曼分析。
2. 结果与讨论
2.1 在线样品准确性验证
为了验证制样方法的准确性及重复性，将本研究制备的70% N2+30% CO2的在线标样与购置于大连大特气体公司生产的同等浓度的商用标样，在10 MPa条件下分别进行了激光拉曼分析。结果表明，本次研究制备的混合气体与商用钢瓶装标样具有相似的峰形(图 2)。利用英国Renishaw公司出品的Wire3.0软件对上述拉曼谱图进行了分析，结果表明本方法制备的混合气体与商用标样具有相似的CO2与N2的相对峰高以及相对峰面积值，其相对误差小于4%，并具有较好的重现性，能够满足实验要求。
![]()
图 2 商用标样与在线样品拉曼谱图Figure 2. The Raman spectra of commercial standard sample and on-line mixing sample2.2 CH4及CO2相对拉曼定量因子的测定
在测定单个包裹体气体组成方面，国内外多沿用“相对拉曼定量因子”的方法，即通常将N2的定量因子定为1.00，其他气体与N2进行比较，得到相对拉曼定量因子[3, 4]。本次研究分别对拉曼峰面积及峰高计算了相对拉曼定量因子，具体公式如下：
式中，Ag为气体g的拉曼峰面积；AN2为N2的拉曼峰面积；Cg为气体g的摩尔分数；CN2为N2的摩尔分数；Hg为气体g的拉曼峰高；HN2为N2的拉曼峰高；Fgr代表以峰面积为参考值时气体g相对于N2的拉曼定量因子；Ggr代表以峰高为参考值时气体g相对于N2的拉曼定量因子。
为了测定CO2以及CH4的相对拉曼定量因子，在室温、5 MPa和10 MPa压力条件下，分别制备了N2摩尔分数为30%、50%和70%的N2-CO2混合气体标样以及N2-CH4混合气体标样。
在上述标样的激光拉曼谱图(图 3)中能清晰地辨识出N2、CO2以及CH4的拉曼特征峰。气体的拉曼峰强度随浓度以及压力的增加而增加，信噪比随着压力由5 MPa增加到10 MPa增大约一倍。
![]()
图 3 N2-CO2以及N2-CH4在线混合气体拉曼谱图Figure 3. The Raman spectra of N2-CO2 and N2-CH4 on-line gas mixturesThis page contains the following errors:
error on line 1 at column 1: Start tag expected, '<' not foundBelow is a rendering of the page up to the first error.
虽然CO2在1286 cm-1附近以及1386 cm-1附近出现两个峰值，但是由于1286 cm-1附近的峰强度要小于1386 cm-1附近峰强度。因此本文仅针对CO2在1386 cm-1附近的峰计算了相对拉曼定量因子。
This page contains the following errors:
error on line 1 at column 1: Start tag expected, '<' not foundBelow is a rendering of the page up to the first error.
求得CH4和CO2相对拉曼定量因子之后，便可以对包裹体中CH4和CO2的相对含量进行计算，具体计算公式如下：
3. 地质样品应用
选取四川金沙岩孔剖面，震旦系的藻云岩样品进行应用研究。该样品溶洞发育，被后期亮晶白云石充填。溶洞充填的亮晶白云石中发育气液两相盐水包裹体。选取个体较大并且靠近样品表面的包裹体，对其气泡进行激光拉曼分析，结果表明包裹体的气泡主要由CH4和CO2组成(图 6)。
利用wire3.0对图 6中两个包裹体的拉曼相关参数进行求解，并分别利用公式(3) 和(4) 对包裹体a和b中的CH4和CO2摩尔浓度进行了计算，得到包裹体中CH4的摩尔分数为27.60%~31.63%，CO2的摩尔分数为68.37%~72.40%(表 1)。上述结果表明，利用本文所求得的拉曼定量因子F和G所得到计算的结果基本一致(两者的绝对偏差在2.5%以内)；包裹体a和b气相组成较接近，可能为同期捕获的产物。
表 1 包裹体样品分析结果Table 1. The analytical composition of gas in fluid inclusions包裹体 ACO2 HCO2 ACH4 HCH4 CCH4(%) CCO2(%) 据公式(3) 据公式(4) 据公式(3) 据公式(4) 包裹体a 3461.54 594.541 17891.2 4115.24 31.63 31.25 68.37 68.75 包裹体b 3137.87 732.481 14694.8 4251.27 29.54 27.60 70.46 72.40 4. 结语
本文利用自主搭建的在线标样制备装置，对N2-CH4以及N2-CO2进行在线混合增压，制备了N2摩尔浓度为30%、50%和70%，压力为5 MPa和10 MPa的N2-CH4以及N2-CO2混合气体在线标样。通过与商用混合钢瓶气体标样对比表明，该方法所使用的装置操作简单，制备的混合气体具有较高的准确性及重现性，能够方便、准确地对拉曼光谱仪进行标定，实现了不同压力和浓度条件下气体的相对拉曼定量因子的测定。通过对CH4及CO2的相对定量因子测定表明，气体压力在5~10 MPa的范围时，定量因子不受压力变化的影响，为固定值。地质样品应用表明，本方法可以方便、灵活、准确地按任意比例将两瓶及两瓶以上纯气体钢瓶样品进行混合及增压，弥补了商用钢瓶装混合气体标样费用高、气体组成单一固定等不足。
由于本次研究仅在5 MPa和10 MPa两个压力点进行了分析，因此对于相对定量因子在 < 5 MPa及 > 10 MPa压力条件下的变化规律还有待于进一步研究。另外由于缺乏已知气体组成的人工合成包裹体标样，对于本方法在包裹体应用中的误差范围还有待于进一步研究。
-
![]()
图 1 三个站点12个层面土壤样品16S rRNA-V3可变区的DGGE图谱
Figure 1. DGGE profiles of the 16S rDNA-V3 region of the twelve layers along the soil sample three stations
![]()
图 2 DGGE分离所得细菌16S rRNA-V3区序列的NTSYS聚类图
Figure 2. NTSYS dendrogram based on 16S rRNA-V3 region sequences from DGGE
![]()
图 3 研究区三站点各层位总微生物群落组成
Figure 3. Microbial community composition of soil horizons from three stations in research area
![]()
图 4 三个站点各层位细菌组成统计
Figure 4. Bacterial composition from three stations in research area
![]()
图 5 实验区三位点中各细菌类群与环境关系的CCA二维排序图
图中各箭头标注代表的环境因子为：TN—总氮； Eh—氧化还原电位； NO3--N—硝基氮； NO2--N—亚硝基氮； NH4+-N—氨氮； WC—含水量； pH—pH值； F-—氟离子； Cl-—氯离子； SO42-—硫酸根离子； NO3-—无机盐硝酸根。三角图标代表文库所包含的所有微生物种群分属的门类：Act—放线菌； Un—未分类序列； ga—γ-变形菌； Bat—拟杆菌； al—α-变形菌； be—β-变形菌； de—δ-变形菌； Fir—壁厚菌； Chl—绿弯菌； Gem—芽单胞菌； Fla—产黄杆菌。
Figure 5. CCA biplot of samples and environmental factors from three stations of research area
表 1 土壤样品环境因子测定方法
Table 1 Determination of environmental factors in soil samples
测试项目 测试方法 土壤含水量 质量法 pH值 电化学分析法 氧化还原电位 电位法 颗粒组成 比重计法 铵态氮 纳氏比色法 硝态氮、总氮 紫外分光光度法 亚硝态氮 N-(1-萘基)-
乙二胺光度法阳离子 电感耦合等离子体
发射光谱法其他阴离子 离子色谱法 
下载: 导出CSV
表 2 引物序列
Table 2 Primer sequence
引物 序列 341F 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 534R 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′ 341F-GC 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′M13-47 5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′ RV-M 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAT ACTC-3′
下载: 导出CSV
表 3 各点位土壤样品理化参数及微生物数量统计
Table 3 physicochemical factors and microorganisms of soil samples
站点 土壤岩性 细菌总数/
(CUF·g-1)深度/m 酸碱度
pH含水率/% 氧化还原电位
Eh/mV干重wB/(mg·kg-1) NH4-N NO3-N NO2-N SO42- T1-1 粉质黏土 5.37×109 1.94 8.73 20.53 247.00 2.24 0.46 0.08 56.22 T1-2 黏土夹砂 7.27×108 3.27 8.73 16.75 201.00 0.52 0.47 0.12 36.61 T1-3 粉细砂 8.17×106 7.45 8.63 18.34 133.10 0.42 0.69 0.13 9.82 T1-4 细砂 2.64×105 8.21 8.68 17.26 107.20 0.53 1.96 0.12 6.62 T2-1 黏土 8.87×109 0.95 8.14 17.77 566.00 21.04 22.21 16.88 19.04 T2-2 粉土 1.53×108 2.21 8.71 17.75 187.60 4.88 5.09 0.35 24.38 T2-3 粉细砂 8.31×106 4.00 8.33 3.83 284.00 9.97 2.04 0.43 49.83 T2-4 粉土 9.53×106 8.15 8.56 9.83 226.00 66.59 11.61 0.81 33.29 T3-1 黏土夹砂 3.22×107 0.27 8.55 0.17 491.00 0.46 4.56 1.34 448.05 T3-2 粉土含砂 1.54×108 1.23 8.63 19.17 372.00 1.11 4.06 2.47 29.10 T3-3 中细砂 8.00×106 3.25 8.62 18.02 90.70 2.48 3.21 0.59 45.75 T3-4 粗砂 1.60×105 4.21 8.73 16.87 86.00 5.16 3.68 0.52 28.00
下载: 导出CSV
-
William J H. Vadose zone microbial biobarriers remove nitrate from percolating groundwater [J]. Current Microbiology, 2009(58): 622-627.
Mamie N I, Kate M S, Dennis E R. Reduction of perchlorate and nitrate by microbial communities in vadose soil [J]. Applied and Environmental Micro-biology, 2005, 71(7): 3928-3934. doi: 10.1128/AEM.71.7.3928-3934.2005
卞华松,张仲燕.冷冻固定化优势菌群处理含甲醛苯酚废水[J].环境科学,1998,19(2): 39-42. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HJKZ802.009.htm 赵娟,吕剑,何义亮,靳强,张文英,何霞.异养脱氮菌株Bacillus sp. LY 降解有毒有机污染物的研究[J].环境科学,2007,28(12): 2838-2842. doi: 10.3321/j.issn:0250-3301.2007.12.030 袁勇军,陆兆新,黄丽金,吕凤霞,别小妹.烟碱降解细菌的分离鉴定及其降解性能的初步研究[J].微生物学报,2005,45(2): 181-184. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-WSXB200502005.htm 洪青,张忠辉,张晓舟,徐剑宏,李顺鹏.中度嗜盐菌Halomonas sp. BYS2 1启动子的克隆和测序[J].应用与环境生物学报,2005,11(6): 729-732. Myers R M, Fischer S G, Maniatis T. Modification of the melting properties of duplex DNA by attachment of a GC-rich DNA sequence as determined by denaturing gradient gel electrophoresis [J]. Nucleic Acids Research, 1985, 13: 3111-3129. doi: 10.1093/nar/13.9.3111
Muyzer G, Brinkhoff T, Nübel U. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology [J]. Molecular Microbial Ecology Manual,1998,3(44): 1-27.
Zweifel U L, Hagstrom A. Total counts of marine bacteria include a large fraction of non- nucleoid-containing bacteria (ghosts) [J].Applied and Environ-mental Microbiology, 1995, 61(6): 2180-2185.
Schallenberg M, Kalff J, Rasmussen J B. Solutions to problems in enumerating sediment bacteria by direct count[J].Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(5): 1214-1219.
Zhou J Z, Bruns M A, Tiedje J M. DNA recovery from soils of diverse composition [J]. Applied and Environ-mental Microbiology, 1996, 62(2): 316-322.
Muyzer G, Dewaal E C, Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993(59): 695-700.
Rohlf F J. NTSYS-PC: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.0 [M].New York: State University of New York, 2000: 97.
Thompson J D, Higgins D G, Gibson T J, Clustal W. Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucleic Acids Research, 1994(22): 4673-4680.
Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA 3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment [J]. Briefings in Bioinformatics, 2004(5): 150-163.
Schloss P D, Handelsman J. Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005(71): 1501-1506.
Selim S, Negrel J, Govaerts C, Gianinazzi S, van Tuinen D.Isolation and partial characterization of antagonistic peptides produced by Paenibacillus sp. Strain B2 isolated from the Sorghum Mycorrhizosphere[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005(71): 6501-6507.
Lin Y, Kong H N, He Y L. Simultaneous nitrification and denitrification in a membrane bioreactor and isolation of heterotrophic nitrifying bacteria [J]. Japanese Journal of Water Treatment Biology, 2004, 40(3): 105-114. doi: 10.2521/jswtb.40.105
Derek R L, Elizabeth J P P. Novel processes for anaerobic sulfate production from elemental sulfur by sulfate-reducing bacteria [J]. Applied and Environ-mental Microbiology, 1994(60): 2394-2399.
Robertson L A, Kuenen J G. Thiosphaera pantotropha gen. nov. sp. nov., a facultatively anaerobic, faculta-tively autotrophic sulphur bacterium [J]. General Microbiology, 1983, 129(9): 2847-2855.
Gupta A B. Thiosphaera pantotropha: A sulphur bacterium capable of simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification[J]. Enzyme & Microbial Technology, 1997(21): 589-595.
Moir J W B, Wehrfritz J M, Spiro S. The biochemical characterization of a novel non-haem-iron hydroxylamine oxidase from Paracoccus denitrificans GB17 [J]. Biochemical Journal, 1996, 319(3): 823-827. doi: 10.1042/bj3190823
Stephen P, Cummings D, Gilmour J. The effect of NaCl on the growth of a halomonas species: Accumulation and utilization of compatible solutes [J]. Microbiology, 1995(141): 1413-1418.
Kim H, Bram V, Lieven W, Willy V, Nico B, Paul D V.Cultivation of denitrifying bacteria: Optimization of isolation conditions and diversity study [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006(72): 2637-2643.
Stefan J G, Om P, Thomas M G. Denitrifying bacteria isolated from terrestrial subsurface sediments exposed to mixed-waste contamination [J]. Applied and Environ-mental Microbiology, 2010(76): 3244-3254.
Christiane W, Andrea T, Antje W. Horizon-specific bacterial community composition of german grassland soils, as revealed by pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010(76): 6751-6759.
Nicole D, Bruno G, Steffen K. Methanotrophic communities in Brazilian Ferralsols from naturally forested, afforested, and agricultural sites[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010(76): 1307-1310.
计量
- 文章访问数: 1128
- HTML全文浏览量: 335
- PDF下载量: 10
京公网安备 11010202008159号