Microbial Ecological Diversity Characteristics of the Soil Profile in the Vadose Zone Polluted by Ammonia Nitrogen
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摘要: 包气带土壤中氨氮污染迁移规律已成为近年来国内外学者研究的重点，目前在氨氮污染迁移规律研究中采用柱实验模拟以及软件模拟的方法较多，土壤生物技术则广泛应用于污染物降解领域，而在污染物迁移规律研究中应用较少。本文采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、16S rRNA序列分析技术以及典范对应分析相结合，对华北平原3个典型氨氮污染区土壤表层至包气带剖面微环境的细菌垂直分布特征及群落结构进行研究。结合污染区土壤理化性质分析，认为包气带土壤剖面的细菌群落中存在着与氮循环、硫酸盐代谢等过程偶联的优势细菌类群，说明土壤微环境中细菌群落分布明显受氨态氮、硝态氮、亚硝态氮和硫酸盐的分布影响，进一步表明污染土壤优势菌群的群落结构信息是描述包气带土壤环境氨氮污染物迁移规律的重要参数。Abstract: Scholars at home and abroad in recent years have focused on researching ammonia nitrogen pollution migration rules in the vadose zone soil. Column simulation and software simulation were primarily conducted for the study of ammonia nitrogen pollution migration. Biotechnology was widely used in degradation of pollutant in soil, but less applied to the study of pollution migration. This study applied Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and the sequence analysis of the V3 Region of 16S rRNA combined with canonical correspondence analysis to characterize the bacteria vertical distribution characteristics and bacterial community structure in the soil from three typical contaminated zones in the North China Plain. According to the analysis of physical and chemical soil properties in polluted areas, there were some dominant individual bacteria in the key pathways of the nitrogen cycle and sulfate metabolism. It is suggested that the bacterial communities are affected by the distributions of ammonia, nitrate and nitrite nitrogen, showing that the community structure information of the dominant population in contaminated soil is an important parameter to study the ammonia nitrogen pollution migration rules.
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包气带作为全球生物地球化学循环的重要地质介质，对地下水生态系统影响显著[1]，其理化因素的空间特异性能够使相应土壤环境中微生物群落发生改变，进而影响氨氮污染物在包气带土壤生态系统中的运移，以及氨氮污染降解菌的分布[2]。近年来，现有的物理化学技术对处理大面积的土体和地下水污染已不具优势，污染土壤生态环境的研究重点已开始转向分子生物修复领域。采用PVA1799冷冻改良技术固定的优势菌群，能够使浓度为565 mg/L的苯酚去除率达到94%以上[3]。在硝化性能明显的氮污染土壤中分离得到的一种微生物Bacillussp. LY能够在有机物去除的同时，将氨氮转化为氮气，并能以多种有机污染物[包括壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)、邻苯二酚及苯酚等]为唯一碳源生长，是新型高效生物脱氮联合去除有机污染物技术的重要突破[4]。土壤环境中分离出具有特殊作用的微生物，一株鉴定为Ochrobactrum intermedium DN2的烟碱降解细菌经证实，能够去除或减少烟草废弃物中烟碱[5]。在苯乙酸废水污染的高盐土壤分离出的中度嗜盐菌 Halomonas sp. BYS-1中分离提取的耐盐基因片段，为耐盐遗传机制的研究提供了高质量实验材料，在盐污染土壤治理中得到有效利用[6]。
反渗透等物理方法以及化学还原脱氮法是去除包气带土壤氨氮污染的传统方法。但是，这些方法并非完全将硝酸盐降解为无毒的气态氮化合物和氮气，仅为硝酸盐的转移，还会产生二次污染问题。近年来，生物脱氮技术尤其是分子生物技术在土壤氨氮污染去除中逐渐得到关注。变性梯度凝胶电泳(简称DGGE)技术能够直接利用DNA及DNA对微生物遗传特性进行表征，不但避免了耗时的传统菌种分离，更可鉴定出无法利用传统方法分离的菌种，它的分辨精度相比琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更加精确，可以检测到一个核苷酸水平的差异[7]。DGGE胶体图谱中出现的可见条带，分别代表土壤样品中优势细菌16S rRNA的目的片段，条带的数量反映出细菌群落组成中的优势群体的数量，条带的强度代表细菌种群中细菌的含量，与模板DNA片段含量成正比[8]。然而该技术的缺点在于，胶体条带的分辨率影响部分条带的生物信息，不能获取到全部的样品微生物信息。此外16S rRNA克隆文库分析也是有效鉴定样品微生物分子生物技术，该方法能够详细地揭示样本中微生物的多样性，能够将样品微生物分类鉴定至种的水平。具体过程是将总DNA由样本中提取出，应用通用引物对其进行16S rRNA基因的扩增，进而建立基因克隆文库，再以限制性内切酶对其进行酶切自由，通过对其16S rRNA基因酶切图谱的分析鉴定微生物的具体分类，得到微生物群落多样性的信息。
针对DGGE技术有限分辨率造成的信息缺失以及克隆文库分析的覆盖范围局限，本文将DGGE技术与克隆序列结合，对微生物群落丰富度的差异进行深层研究，同时通过典范对应分析对污染源区微生物群落多样性及生态分布特征进行评估，以期揭示氨氮污染源区包气带土壤理化性质对其细菌群落结构的塑造作用，为通过细菌生态系统变化反映污染物在包气带中的分布和迁移规律提供理论依据。
1. 实验部分
1.1 仪器和装置
PCR扩增仪(CFX9，美国Bio-rad公司)，凝胶成像分析系统(GelDoc XR，美国Bio-rad公司)，变性梯度凝胶电泳仪(DCode，美国Bio-rad公司)，琼脂糖凝胶电泳仪(DYCP-44P，北京六一仪器生产公司)，小型高速台式离心机(5418型，德国Eppdorf公司)，高速冷冻离心机(3K30，美国Sigma公司)，-80℃冰箱(美国Thermo Electron Corporation公司)，高温高压灭菌锅(LDZM-60KCS，上海医疗器械厂)，旋涡混合器(Vortex-Genie 2T，美国Scientific Industries公司)，洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰)，恒温摇床(THZ-82A型，苏州威尔)，电热恒温水槽(DK8D，上海风棱)，电热恒温培养箱(DNP-9052，苏州威尔)，电子分析天平(AL204，美国梅特勒公司)，哈纳多参数测定仪(HI8320型，意大利Hanna公司)。
1.2 主要试剂
去离子水(Millipore纯化柱)，丙烯酰胺(纯度>99.0%，美国Sigma公司)，双丙烯酰胺(纯度≥99.9%，美国Promega公司)，尿素(纯度≥99.5%，美国Sigma公司)，Tris碱(纯度≥99.9%，美国Promega公司)，EDTA二钠(EDTA-Na2·2H2O，纯度≥99.9%，美国Promega公司)，去离子甲酰胺(纯度>99.5%，美国Amresco公司)，甲酰胺(纯度>99.5%，美国Amresco公司)，TEMED(纯度≥99%，美国Sigma公司)，过硫酸铵(纯度≥99.9%，美国Promega公司)，CTAB(生化级，纯度≥99.0%，美国Sigma公司)。
乙酸(分析纯，纯度≥99.5%)，乙醇(分析纯，纯度≥99.7%)，NaOH(分析纯，纯度≥99.5%)，甲醛(分析纯，纯度≥99.5%)，NaCl(分析纯，纯度≥99.5%)，Na2HPO4(分析纯，纯度≥99.5%)，KH2PO4(分析纯，纯度≥99.5%)：这些试剂均购自北京化学试剂公司。
EB (10 mg/mL母液，上海生工生物有限公司)，FastDNA Spin Kit for Soil (美国公司)，DNA胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。
Tris-盐酸溶液(1 mol/L，pH 8.0)：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 mL溶解，滴加浓盐酸约2.1 mL调pH至8.0，定容至50 mL。
EDTA(0.5 mol/L，pH 8.0)：称取9.306 g 的EDTA二钠，加超纯水35 mL，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 mL。
TAE(50×)缓冲液：Tris-HCl 2 mol/L，CTAB 50 mmol/L，EDTA (0.5 mol/L，pH＝8.0) 20 mmol/L。
PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH＝7.4)配方：NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4 1.44 g/L，KH2PO4 0.24 g/L。
TE(1×)缓冲液：1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 1 mL，0.5 mmol/L EDTA(0.5 mol/L，pH＝8.0) 0.2 mL。超纯水定容至100 mL。
1.3 场地概况与样品采集
采样区位于华北平原温榆河畔与北京城区之间，区域平均海拔约20 m，上覆厚度为10~15 m黏土层，含水层为4~10 m，具体由埋深0~2 m的杂性土壤层、埋深为2~10 m的粉质黏土夹粉土层以及埋深为10~25 m的粉砂-细沙层组成。取样区域单层含水层厚度一般小于5 m，部分地区可大于5 m，累计厚度在20 m左右，局部地段大于30 m，整体渗透系数在30~50 m/d之间。土壤样品的采集点(T1、T2和T3)地处东经116°33′，北纬39°59′范围内，T1位点位于靠近城区的生活潜在污染区，T2位点位于市郊果蔬种植场地，T3位点为靠近温榆河岸及垃圾填埋厂的污染区域。
各站点土壤的野外采集完成后，迅速将样品统一置于无菌盒中，贴好标签密封，返回实验室后置于-70℃超低温冰箱内长期保存，用于后续微生物计数和核酸提取。
1.4 样品环境因子测定
土壤样品pH值及电导率等参数利用哈纳多HI8320参数测定仪进行现场测定，颗粒组成、土壤含水率、三氮含量及其他化学成分由后期实验测定，其他具体理化参数测定遵循表 1所列的标准方法。
表 1 土壤样品环境因子测定方法Table 1. Determination of environmental factors in soil samples测试项目 测试方法 土壤含水量 质量法 pH值 电化学分析法 氧化还原电位 电位法 颗粒组成 比重计法 铵态氮 纳氏比色法 硝态氮、总氮 紫外分光光度法 亚硝态氮 N-(1-萘基)-
乙二胺光度法阳离子 电感耦合等离子体
发射光谱法其他阴离子 离子色谱法 1.5 荧光染料(DAPI)计数
取0.5 g冻存土样和3.5 mL无菌水，用匀浆器充分混匀，再加1.5 mL含有0.05% TritonX-100的3×PBS缓冲液，750 g离心1 min(约2500 r/min),取1 mL上清液，与3 mL 4%多聚甲醛均匀混合，4℃放置过夜以固定细胞。1 mL细胞固定液中加染料DAPI至终浓度为200 ng/mL，染色10 min后用细菌滤器过滤，使菌体集中在0.22 μm聚碳酸滤膜(Waterman滤膜)上，取下滤膜置于载玻片上迅速进行镜检。随机计数10个视野中的菌体个数取平均值，计算出每克土样中菌体细胞总数[9-10]。
1.6 样品中总DNA提取及细菌16S rRNA-V3可变区片段的扩增
取5 g冻存样品装入10 mL离心管中，加入4 mL裂解缓冲液[3% CTAB，100 mmol/L Tris-盐酸(pH=8.0)，100 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl，2% β巯基乙醇(V/V)，1% PVP]，充分研磨，旋涡振荡仪剧烈振荡，尽量使沉积物悬浮于裂解缓冲液中。加入蛋白酶K至终浓度1 mg/mL，55℃温浴1 h，其间每15 min补充一次蛋白酶K。将裂解后的上清液分装到4个1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24∶1) ，以12000 g转速4℃离心10 min，抽提两次。取上清液加1/10体积3 mol/L醋酸钠和预冷的等体积异丙醇，于-20℃放置1 h后以12000 g的转速4℃离心15 min，弃上清液，剩余沉淀用1 mL 70%乙醇洗涤一次，自然干燥，用50 μL 1×TE缓冲液 (pH=8.0)溶解沉淀[11]。
利用16S rRNA-V3区引物341F/534R扩增样品DNA序列，上游引物341F包括一段5'黏性末端连接GC夹子结构的前导区，具体序列成分见表 2[12]。PCR反应体系为：DNA模板1 μL；引物10 pmol；TaqDNA聚合酶1U；2.5 mol/L dNTP，4 μL；5×PCR缓冲液，10 μL；Mg2+溶液1.6 μL；去离子水补至50 μL。PCR反应条件为：95℃预变性4 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的PCR产物利用产物纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)进行纯化。
表 2 引物序列Table 2. Primer sequence引物 序列 341F 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 534R 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′ 341F-GC 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′M13-47 5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′ RV-M 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAT ACTC-3′ 1.7 细菌16S rRNA V3可变区片段的DGGE分离与聚类分析
将40 μL的16S rRNA-V3区PCR胶回收产物，用变性梯度凝胶电泳仪(D-Code system,BIO-RAD,Hercules,CA,USA)进行DGGE分离。PAGE胶浓度为8%，变性梯度30%～60%，60℃，80 V电压，1×TAE(20 mmol/L Tris基质，10 mmol/L醋酸钠，0.5 mmol/L EDTA)缓冲液中运行13 h。电泳后EB染色30 min，置于凝胶成像仪紫外光下检测并照相。
利用NTsys软件对DGGE凝胶电泳胶体上条带位置及条带亮度进行测定[13]，对DGGE条带分离出的优势菌群进行UPGMA聚类及丰度分析，得到以皮尔森相似度为基础的聚类分析结果，并通过离差平方和法绘制聚类树状图。聚类树状图中，纵轴站点两个对象延长线交线垂直于横轴相似系数，对应横轴上的数据即为两者之间的相似度。同样，4个层位延长线与另外4个层位延长线的垂直交线对应数据，即为两站点间的相似程度。
1.8 细菌16S rRNA-V3区序列的克隆和测序
紫外灯下对成型的DGGE凝胶进行检测，将紫外光激发下可见的凝胶条带切下，用去离子水冲洗3次后，浸入50 μL去离子水中，4℃过夜沉淀。取各样品浸出液2 μL为模板再次进行PCR扩增，二次PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，连接到PMD18-T载体(TAKARA，大连)上，经热激法转化到大肠杆菌TOP10细胞中，涂布含有Amp/X-Gal /IPTG的LB平板，37℃静置培养16 h。然后4℃静置1 h，使蓝色充分显现后，随机调取白色菌落到新的培养平板内过夜培养。随机挑取单个白色菌落，加入含100 μL ddH2O的PCR管内，置于PCR仪99℃加热裂解细胞。取2 μL裂解液作为模板，利用M13-47和RV-M为引物(具体序列列于表 2)，进行后续的PCR扩增，验证插入片断的大小，筛选阳性克隆。将筛选好的阳性克隆保存于1 mL含有20%甘油的液体LB培养基中，每个平板随机选取10株已得到验证的阳性克隆进行测序(BGI，北京)。
1.9 典范对应分析(CCA)
将三个站点土壤样品的理化因子数据，包括pH值、Eh值、含水率、硝态氮含量、亚硝态氮含量、氨态氮含量、氟离子及氯离子含量，与克隆文库测得的土壤细菌群落组成进行了典范对应分析，分为两个数据矩阵，即土壤理化因子数据矩阵以及土壤细菌群落组成数据矩阵。通过Canoco软件计算分析出生态重要理化因子与土壤细菌群落分布之间的相互影响关系，从而分析出单个环境因子对细菌群落组成的具体影响。
1.10 核酸序列登录号
通过随机测序共获得107个16S rRNA-V3区序列，利用Check-Chimera检测(http://rdp8.cme.msu.edu/cgis/Himera.cgi?su=SSU)，将其中的嵌合体等不正常的序列剔除，81个属于正常序列。本实验中采用的全部序列已提交到GenBank，序列号(Accession Number)为HQ916750~HQ916804。
1.11 系统发育与统计分析
获得的16S rRNA-V3区序列通过BLAST工具从GenBank获得与本实验所得到序列亲缘关系最近的类群序列。使用Thompson等[14]的方法对这些16S rRNA序列进行比对，然后利用MEGA3.0[15]中的Neighbor-Joining模型进行系统发育与进化分析。并利用DOTUR软件(以DNA序列间距划分微生物分类及多样性的软件)版本1.53[16]比较本实验三个站点共12个土层样品的细菌多样性，将相似性≥98%的细菌16S rRNA基因序列归为同一可操作分类单元(OUT)。
2. 结果与讨论
2.1 土壤样品细菌总数统计及环境理化因素测定
实验区三个站点土壤样品的pH值均为8.0以上；含水量在各点的变化较小，均在15%以上；氨氮含量及硝基氮含量在T2站点积累较为明显，在站点T3积累其次，而T1站点三氮含量检出较站点T2与T3明显减少，亚硝氮在站点T3的表层位点含量较高，在T1站点及T2站点中没有明显积累；三个站点中硫酸盐含量不均，在6.62~448.05 mg/kg之间(表 3)。各站点12个土壤样品中，土壤岩性细菌总数在1.6×105~8.87×109范围之内。
表 3 各点位土壤样品理化参数及微生物数量统计Table 3. physicochemical factors and microorganisms of soil samples站点 土壤岩性 细菌总数/
(CUF·g-1)深度/m 酸碱度
pH含水率/% 氧化还原电位
Eh/mV干重wB/(mg·kg-1) NH4-N NO3-N NO2-N SO42- T1-1 粉质黏土 5.37×109 1.94 8.73 20.53 247.00 2.24 0.46 0.08 56.22 T1-2 黏土夹砂 7.27×108 3.27 8.73 16.75 201.00 0.52 0.47 0.12 36.61 T1-3 粉细砂 8.17×106 7.45 8.63 18.34 133.10 0.42 0.69 0.13 9.82 T1-4 细砂 2.64×105 8.21 8.68 17.26 107.20 0.53 1.96 0.12 6.62 T2-1 黏土 8.87×109 0.95 8.14 17.77 566.00 21.04 22.21 16.88 19.04 T2-2 粉土 1.53×108 2.21 8.71 17.75 187.60 4.88 5.09 0.35 24.38 T2-3 粉细砂 8.31×106 4.00 8.33 3.83 284.00 9.97 2.04 0.43 49.83 T2-4 粉土 9.53×106 8.15 8.56 9.83 226.00 66.59 11.61 0.81 33.29 T3-1 黏土夹砂 3.22×107 0.27 8.55 0.17 491.00 0.46 4.56 1.34 448.05 T3-2 粉土含砂 1.54×108 1.23 8.63 19.17 372.00 1.11 4.06 2.47 29.10 T3-3 中细砂 8.00×106 3.25 8.62 18.02 90.70 2.48 3.21 0.59 45.75 T3-4 粗砂 1.60×105 4.21 8.73 16.87 86.00 5.16 3.68 0.52 28.00 研究区剖面土壤样品各环境因素的测定结果表明，总氮及各类污染氮素的分布及含量在各采样站点差异明显，最高站点约是最低站点的60倍。取样位点的土壤环境中NO2-N、NO3-N、NH4-N、SO42-等阴离子的含量过高，表明研究区土壤处于氮素及无机盐类污染状态，地下水环境极有可能因此受到威胁。
其中，研究区T1位点土壤的总微生物量随地层深度加深明显减少，说明细菌数量随地层增加、有机质含量减少而减少。同时，表 3数据还反映出，研究区内部水平方向微生物菌群分布基本均匀，但影响细菌总数的因素并不单一，研究区T2站点中深层位点(地下8 m左右)与中层位点(地下3 m左右)的细菌总量同属一个数量级，说明其他土壤理化因素的改变，如污染氮素的异常积累、土壤含水率及溶氧量等同样是影响土壤微生物总量的关键因素。研究区T3站点同样存在特例，表层的细菌总数略低于地下浅层的细菌总数，说明土壤样品中细菌的含量并非随地层加深而增多，站点中土壤颗粒组成变化仍是影响细菌总量的主要因素。
2.2 基于DGGE的微生物多样性分析
对研究区T1、T2及T3共12个土层进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)的测定，结果表明三个站点的土壤细菌群落具有较为明显的差异(如图 1所示)。12个泳道中产生的条带均聚集在胶体的中间部位(该区域的变性浓度属于高低混合)。DGGE胶体图谱中共出现85条可见条带，并标注出35条亮度明显、位置清晰的DGGE胶体条带，代表土壤样品中优势细菌16S rRNA 目的片段，进行后续序列分析。
DGGE胶体图谱中，站点T1中表层土壤及浅层土壤的DGGE条带分布较为相似，各层位条带随深度增加亮度降低、种类也相应减少，部分菌群(条带1、3、4、6、8、9)表现尤为明显。结合表 3中各站点土壤理化参数分析，包气带土壤剖面表层至底层之间微生物多样性发生的明显改变，与层位加深后土壤颗粒结构改变造成的有机质积累变化相关。
同时表现在DGGE图谱中，站点T2各层位的条带随层位加深变化并不明显，除部分菌群(条带17、18、19、21、24)为个别层位的特别优势菌群外，其他菌群(条带12、13、14、15、20)均贯穿于所有层位土壤之中，这与该位点各层位相似的土壤颗粒组成(表层至底层多以黏土及粉质黏土为主)，及相似的污染物积累状态(氮污染积累较为明显)关系密切。
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图 1 三个站点12个层面土壤样品16S rRNA-V3可变区的DGGE图谱Figure 1. DGGE profiles of the 16S rDNA-V3 region of the twelve layers along the soil sample three stations站点T3在DGGE图谱中的条带分布表明，表层及浅层土壤的细菌群落分布相似性很高，条带27～34所对应的细菌菌群在两层位中的含量存在差异，而细菌种类几乎没有改变，但该层位见水较浅，且土壤颗粒变化较大，因此表层及浅层中大量存在的优势细菌群落在位处浅层饱水带的T3-3及T3-4层位中逐渐消亡，仅有少量优势菌群存在(条带29、30、31)并新增一种优势菌(条带35)，说明该位点土壤颗粒吸附细菌的能力随土壤剖面加深而减弱，同时较深层位污染物浓度的增加，也是造成土壤剖面细菌多样性分布差异明显的主要原因。
使用软件NTsys Version 2.0[13]根据DGGE图谱中每条带所建立的矩阵进行聚类分析，通过非加权组平均法(UPGMA)分析表明三个站点之间的群落结构相似程度均存在变化，聚类图如图 2所示，横线链接的末端垂线所对应的数值即为两者的相似程度，如图中站点T1表层T1-1与T1-3的微生物群落结构最相近，相似度为90%左右。说明T1-3中部分微生物种群在较深地层仍然存在。地下浅层T1-2与表层T1-1相比，微生物群落结构变化稍明显，相似度为 86%。而随着地层的加深，底层T1-4的微生物群落分布明显不同于另外三层，相似度约只有75%。
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图 2 DGGE分离所得细菌16S rRNA-V3区序列的NTSYS聚类图Figure 2. NTSYS dendrogram based on 16S rRNA-V3 region sequences from DGGE同样站点T2各层位的微生物群落结构也存在差异，T2-2层与其他三层差别最明显，相似度只有76%左右，而地层T2-4与T2-1及T2-3两层的群落结构相似度则保持在80%以上，其中表层T2-1与地下深层T2-3的微生物群落结构相似度最高，达到88%。
站点T3的各层位群落结构差异较为明显，反映在图谱中的成层分布差异较大。表层T3-1与T3-2之间的相似度达到96%，而深层T3-3与T3-4之间的群落结构相似度同样为96%。但较浅两层与较深两层之间的差异明显，只达到80%，说明浅层与深层土壤剖面的微生物群落结构变化较大。
反映在三个站点之间的群落结构相似性，站点T1与站点T3的群落结构较为接近，相似度达到75%，而站点T2与其他两个站点T1、T3差异较大，相似度只有57%。说明微生物菌群在站点T1及T2之间变化不大，但站点T3与站点T1及T2的细菌群落结构分布差异均比较明显，原因在于站点T3紧靠温榆河畔，包气带地层见水层位较浅，土质成多为砂质土壤，造成站点T3的微生物群落结构变化明显。
2.3 细菌群落结构及系统发育分析
将DGGE分离出的优势细菌条带(分别标记为条带1~35)在NCBI 基因库(NCBI，(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，中进行序列比对发现，实验区12个土壤样品中提取出的81个正常细菌16S rRNA序列共54个不同亲缘类型(OUT)，分属于11个系统发育门类。如图 3所示，各分属具体细菌门类及所占细菌总亲缘类型比例分别为：α-变形细菌(7%)，β-变形细菌(10%)，γ-变形细菌(25%)，δ-变形细菌(7%)，厚壁菌(4%)，酸杆菌(7%)，放线菌(3%)，绿弯菌(3%)，拟杆菌(4%)，产黄杆菌(2%)，芽单胞菌(5%)和未分类细菌(26%)。
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图 3 研究区三站点各层位总微生物群落组成Figure 3. Microbial community composition of soil horizons from three stations in research area基于16S rDNA基因序列相似性≥98%的准则，选取DGGE图谱(图 1)中得到的部分代表条带进行序列系统发育分析，结果表明细菌类群在不同站点和层位中的分布存在显著差异。
如图 4所示，T1站点4个层位样品中的优势细菌类群是γ-变形细菌(代表条带3、7)，δ-变形细菌(代表条带2、8)，α-变形细菌(代表条带5)，绿弯菌(代表条带1)，厚壁菌(代表条带4、9)和芽孢杆菌(代表条带6)，另外在该站点深层区域T1-4土壤样品中，检出少量产黄杆菌(代表条带10)和放线菌(代表条带11)。根据测序结果，发现该站点土壤总细菌中γ-变形细菌在所占比例最大为36.4%，其次是厚壁菌和δ-变形细菌(占到18.2%)，绿弯菌占到13.6%，芽孢杆菌所占比例为9%，产黄杆菌及放线菌所占总菌类的比例仅为4.5%，其余菌种属于未分类细菌。
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图 4 三个站点各层位细菌组成统计Figure 4. Bacterial composition from three stations in research area随着深度的增加，底层T1-4中的优势细菌主要为产黄杆菌。该站点由于表层覆盖建筑垃圾杂填土，浅层土壤颗粒为粉质黏土，深层主要由粉细砂、细砂组成。地下污染氮素及以硫酸根离子为代表的无机盐在粉质黏土及黏土层积累明显，在以细砂为主的土层中含量迅速降低，γ-变形细菌占绝对优势。另外厚壁菌、δ-变形细菌、芽孢杆菌和绿弯菌同样是表层的优势细菌群，其中厚壁菌类细菌与来自植物根系土壤的细菌亲缘性较高[17]，尤其发现一类异养脱氮细菌Bacillus sp.菌属与氮循环密切相关[18]。另有分属于δ-变形菌的除硫单胞菌属(Desulfuromonas) 被认为在硫循环中具有重要的作用[19]，同样仅存在于土质为粉质黏土和黏土夹细砂的T1-1及T1-2层位中，说明相对砂质土壤硫酸根离子蓄积量较高的黏土质土壤为是该类细菌生存的首选环境。
T2站点4个层位样品中的优势细菌类群是β-变形细菌(代表条带14、23)，γ-变形细菌(代表条带12、19、24、25)，α-变形细菌(代表条带20、21)，拟杆菌(代表条带15、22)，δ-变形细菌(代表条带16、17、18)，产黄杆菌(代表条带26)和酸杆菌(代表条带13)。序列测试结果显示，各类细菌所占该站点总菌比例分别为β-变形细菌 (21.6%)、γ-变形细菌 (19.6%)、α-变形细菌 (17.6%)、拟杆菌(17.6%)、δ-变形细菌(5.9%)、酸杆菌(7.8%)和产黄杆菌(2%)，其余属于未分类细菌。
该站点位于长期受到含氮类农药污染的城郊果蔬种植园，分析其土壤环境发现，该区域氨态氮积累极为严重，尤其在地下浅层与饱和带之间积累更加显著。硝态氮及亚硝态氮含量随层位加深呈递减趋势，说明在这些层位的土壤微环境中发生了较为明显的反硝化作用，其中占绝对优势的细菌均属于反硝化细菌类别，如假单胞菌和反硝化菌(Paracoccus pantotrophus ATCC 35512)。此类细菌能够利用硝酸根、亚硝酸根、氮氧化物作为末端电子受体，以还原性硫化物为能源生长[20-22]，进而解释了站点T2中亚硝态氮随层位增加的现象。另外，分属变形菌γ亚纲的高度耐盐菌盐单胞菌(Halomonas sp.)生存于硫酸盐含量较高的T2站点粉质土壤中，与其亲缘关系最近的物种来自于苯乙酸废水的高盐污泥[23]，这类细菌的存在多数受污染盐类含量的影响。T2站点的各层位中还存在着各类有机污染的降解菌，如分属于δ-变形细菌的地杆菌(Geobacteraceae)、放线菌、β-变形菌以及拟杆菌等，这些门类的细菌多来自混合污染土壤及淤泥中[24-25]。但草地土壤[26]、农田[27]等环境的常见细菌绿弯菌、芽孢杆菌及厚壁菌未在T2站点中检出。
T3站点4个层位样品中γ-变形细菌(代表条带30、31、32、35)占较大优势，是总菌量的17.6%，δ-变形细菌(代表条带33)、β-变形细菌(代表条带28)、芽孢杆菌(代表条带29)、拟杆菌(代表条带34)和酸杆菌(代表条带27)所占比例均在8.0%左右，厚壁菌及产黄杆菌所占比例仅为2.1%，其余菌种属于未分类细菌。
毗邻河道的站点T3，与站点T1及T2相比，饱水带层位较浅，土壤密度较大，砂含量较高。由于主要颗粒组成为粉土夹粉细砂的表层土壤T1，相比有黏土夹层的浅层土壤T2积累污染物质及吸附微生物的能力略差，剖面表层T3-1、T3-2层位的优势细菌群组成属于群落多样性较为丰富的一层。站位T3氨态氮含量由浅层到深层饱和层逐渐增加，黏质土壤层位T3-1中硝态氮及亚硝态氮也有明显积累，微生物数量和种类较为丰富。但随着层位的加深，土壤受污染程度加大，包气带砂质土壤中微生物吸附能力衰减，使微生物尤其是优势硝化菌群减种类大幅下降，硝化反应程度减弱，氨态氮转化为硝态氮及亚硝态氮的程度也连锁性降低，造成细菌的群落多样性随着取样地层的加深而明显减少。
2.4 细菌类群的分布与环境因子的典范对应分析(CCA)
各站点三氮量、含水率、pH值、总氮、阴离子含量等环境因子与克隆文库细菌群落的典范对应分析结果显示(图 5)，实验区各采样站点微生物组成在二维排序图上的分布与各种理化因子具有一定的联系。位于二维排序图左上方的物种有β-变形菌、放线菌、芽单胞菌和拟杆菌等，在实验区土壤中的分布与总氮含量呈明显正相关。放线菌及α-变形菌的分布与阴离子因素有一定的相关性，同时α-变形菌门与硝基氮含量显著正相关，而亚硝基氮含量及氨氮含量是影响排序图中右下方γ-变形菌分布的关键参数。δ-变形细菌和含水量具有显著的正相关性，与其他阴离子因素，如氟离子等，也有一定的相关性，表明这类细菌主要分布在盐类含量较高的地区。图 5左下方的绿弯菌、壁厚菌受含水量及pH值影响较大，这两种参数值的平稳与否决定了两类菌群生长的状态。实验区存在的未分类菌群分布受pH值及含水量影响较大，同时与亚硝基氮及氨氮含量呈负相关。
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图 5 实验区三位点中各细菌类群与环境关系的CCA二维排序图图中各箭头标注代表的环境因子为：TN—总氮； Eh—氧化还原电位； NO3--N—硝基氮； NO2--N—亚硝基氮； NH4+-N—氨氮； WC—含水量； pH—pH值； F-—氟离子； Cl-—氯离子； SO42-—硫酸根离子； NO3-—无机盐硝酸根。三角图标代表文库所包含的所有微生物种群分属的门类：Act—放线菌； Un—未分类序列； ga—γ-变形菌； Bat—拟杆菌； al—α-变形菌； be—β-变形菌； de—δ-变形菌； Fir—壁厚菌； Chl—绿弯菌； Gem—芽单胞菌； Fla—产黄杆菌。Figure 5. CCA biplot of samples and environmental factors from three stations of research area3. 结语
本研究样品所处的地下水系统中具有显著的空间特异性，地下水系统中微生物群落沿不同地层的成层分布特征与地球化学特征的成层分布相吻合。地下微环境中存在的微生物群落多为与氮循环有关的优势细菌个体，而总体群落结构分析表明该区域存在的微生物及其群落还参与着生态系统中硫酸盐等无机离子代谢的过程。研究结果表明研究区各站点土壤颗粒结构是影响包气带环境中多种污染物迁移转化及微生物群落多样性的关键，污染物在土层中的分布变化是细菌群落结构更替的主要驱动力，而土壤中的微生物也是污染物迁移过程中不可或缺的作用因素。通过对细菌群落结构分布与包气带土壤环境的地球化学性质分析，本研究揭示了地下水微环境中典型污染物迁移与细菌生态系统具有密切相关性，将为进一步研究包气带土壤理化参数对地下水环境的影响奠定基础。
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图 1 三个站点12个层面土壤样品16S rRNA-V3可变区的DGGE图谱
Figure 1. DGGE profiles of the 16S rDNA-V3 region of the twelve layers along the soil sample three stations
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图 2 DGGE分离所得细菌16S rRNA-V3区序列的NTSYS聚类图
Figure 2. NTSYS dendrogram based on 16S rRNA-V3 region sequences from DGGE
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图 3 研究区三站点各层位总微生物群落组成
Figure 3. Microbial community composition of soil horizons from three stations in research area
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图 4 三个站点各层位细菌组成统计
Figure 4. Bacterial composition from three stations in research area
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图 5 实验区三位点中各细菌类群与环境关系的CCA二维排序图
图中各箭头标注代表的环境因子为：TN—总氮； Eh—氧化还原电位； NO3--N—硝基氮； NO2--N—亚硝基氮； NH4+-N—氨氮； WC—含水量； pH—pH值； F-—氟离子； Cl-—氯离子； SO42-—硫酸根离子； NO3-—无机盐硝酸根。三角图标代表文库所包含的所有微生物种群分属的门类：Act—放线菌； Un—未分类序列； ga—γ-变形菌； Bat—拟杆菌； al—α-变形菌； be—β-变形菌； de—δ-变形菌； Fir—壁厚菌； Chl—绿弯菌； Gem—芽单胞菌； Fla—产黄杆菌。
Figure 5. CCA biplot of samples and environmental factors from three stations of research area
表 1 土壤样品环境因子测定方法
Table 1 Determination of environmental factors in soil samples
测试项目 测试方法 土壤含水量 质量法 pH值 电化学分析法 氧化还原电位 电位法 颗粒组成 比重计法 铵态氮 纳氏比色法 硝态氮、总氮 紫外分光光度法 亚硝态氮 N-(1-萘基)-
乙二胺光度法阳离子 电感耦合等离子体
发射光谱法其他阴离子 离子色谱法 
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表 2 引物序列
Table 2 Primer sequence
引物 序列 341F 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 534R 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′ 341F-GC 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′M13-47 5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′ RV-M 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAT ACTC-3′
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表 3 各点位土壤样品理化参数及微生物数量统计
Table 3 physicochemical factors and microorganisms of soil samples
站点 土壤岩性 细菌总数/
(CUF·g-1)深度/m 酸碱度
pH含水率/% 氧化还原电位
Eh/mV干重wB/(mg·kg-1) NH4-N NO3-N NO2-N SO42- T1-1 粉质黏土 5.37×109 1.94 8.73 20.53 247.00 2.24 0.46 0.08 56.22 T1-2 黏土夹砂 7.27×108 3.27 8.73 16.75 201.00 0.52 0.47 0.12 36.61 T1-3 粉细砂 8.17×106 7.45 8.63 18.34 133.10 0.42 0.69 0.13 9.82 T1-4 细砂 2.64×105 8.21 8.68 17.26 107.20 0.53 1.96 0.12 6.62 T2-1 黏土 8.87×109 0.95 8.14 17.77 566.00 21.04 22.21 16.88 19.04 T2-2 粉土 1.53×108 2.21 8.71 17.75 187.60 4.88 5.09 0.35 24.38 T2-3 粉细砂 8.31×106 4.00 8.33 3.83 284.00 9.97 2.04 0.43 49.83 T2-4 粉土 9.53×106 8.15 8.56 9.83 226.00 66.59 11.61 0.81 33.29 T3-1 黏土夹砂 3.22×107 0.27 8.55 0.17 491.00 0.46 4.56 1.34 448.05 T3-2 粉土含砂 1.54×108 1.23 8.63 19.17 372.00 1.11 4.06 2.47 29.10 T3-3 中细砂 8.00×106 3.25 8.62 18.02 90.70 2.48 3.21 0.59 45.75 T3-4 粗砂 1.60×105 4.21 8.73 16.87 86.00 5.16 3.68 0.52 28.00
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