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应用GasBench Ⅱ-IRMS优化碳氧同位素分析方法

朱园园, 邱海鸥, 杜永, 汤志勇, 帅琴, 宋虎跃

朱园园, 邱海鸥, 杜永, 汤志勇, 帅琴, 宋虎跃. 应用GasBench Ⅱ-IRMS优化碳氧同位素分析方法[J]. 岩矿测试, 2014, 33(6): 789-794.
引用本文: 朱园园, 邱海鸥, 杜永, 汤志勇, 帅琴, 宋虎跃. 应用GasBench Ⅱ-IRMS优化碳氧同位素分析方法[J]. 岩矿测试, 2014, 33(6): 789-794.
Yuan-yuan ZHU, Hai-ou QIU, Yong DU, Zhi-yong TANG, Qin SHUAI, Hu-yue SONG. Evaluation and Optimization of Carbon and Oxygen Isotopes Experimental Conditions Determinated by GasBenchⅡ-IRMS Method[J]. Rock and Mineral Analysis, 2014, 33(6): 789-794.
Citation: Yuan-yuan ZHU, Hai-ou QIU, Yong DU, Zhi-yong TANG, Qin SHUAI, Hu-yue SONG. Evaluation and Optimization of Carbon and Oxygen Isotopes Experimental Conditions Determinated by GasBenchⅡ-IRMS Method[J]. Rock and Mineral Analysis, 2014, 33(6): 789-794.

应用GasBench Ⅱ-IRMS优化碳氧同位素分析方法

基金项目: 

国家自然基金项目资助(41172312;41402302);生物地质与环境地质国家重点实验室自主课题资助(GKZ14Y663)

详细信息
    作者简介:

    宋虎跃, 讲师, 从事稳定同位素分析测试及古环境应用研究. E-mail: shycug@gmail.com

  • 中图分类号: O657.63;O628.21

Evaluation and Optimization of Carbon and Oxygen Isotopes Experimental Conditions Determinated by GasBenchⅡ-IRMS Method

  • 摘要: GasBenchⅡ-连续流稳定同位素质谱仪(IRMS)联用在线分析已成为碳酸盐碳氧同位素分析测试的常用方法, 已有研究认为不同的实验条件直接影响δ13C和δ18O同位素测试结果的准确性。但这些报道未对该联用方法所涉及的实验条件进行综合分析。本文系统研究了GasBenchⅡ-IRMS法中各种实验条件(包括排空时间、反应温度、反应时间和色谱分离温度)对碳氧同位素测试结果的综合影响。结果表明:排空时间大于9 min可有效消除空气对测试结果的干扰, 不同的反应温度和时间对碳氧同位素分析结果均有一定影响, 经条件优化确定反应温度为72℃, 反应时间为60 min, 色谱分离温度为60℃。在优化的实验条件下, 碳氧同位素分析精度分别优于0.03‰和0.05‰, 达到了国际分析测试水平。同时, 选择合适的同位素数据归一化方法可以进一步保证碳氧同位素测试结果的准确性和可靠性。通过分析近4000件实际样品, 对比单一标准物质校准和双标准物质校准同位素归一化方法的计算结果, 发现双标准物质校准偏差小于单一标准物质校准偏差, 因此建议采用双标准物质校准法进行样品同位素标准化计算。本研究为GasBenchⅡ-IRMS联用技术中实验条件的选取提供了一定的参考, 保证碳氧同位素测试结果的可靠性和准确性。同时提出, 由于样品成分复杂且不均一, 在分析实际样品时需要根据样品的性质进一步对实验条件进行考察。

  • 盐酸阿考替胺是由日本Zeria公司研制的一种新型Ml、M2受体拮抗剂,临床上用于提高胃的蠕动,以治疗功能性消化不良[1],2013年2月在日本批准上市。与一般促胃肠动力药(伊托必利、莫沙比利)不同,盐酸阿考替胺能够通过促进肠内胆碱神经末梢乙酰胆碱的释放来提高胃肠蠕动[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8],为第一个胃肠蠕动改善药物。盐酸阿考替胺三水合物的化学名为N-{2-[1-甲基乙基]乙基}-2-[(2-羟基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基)氨基]噻唑-4-甲酰胺盐酸盐三水合物(结构图见图 1)。目前,促胃动力药占消化道用药的市场份额呈现出快速增长的趋势,因此,盐酸阿考替胺三水合物有着巨大的市场前景。本世纪初,国外已有盐酸阿考替胺水合物合成方法的报道[9]。近年来,国内外相继出现多篇关于盐酸阿考替胺以及盐酸阿考替胺三水合物合成方法的专利[10, 11, 12, 13, 14, 15]。对于一个产品,分析测试不仅可以对产品的质量进行检验,还对产品研发和生产起着重要的指导作用[16],然而对盐酸阿考替胺三水合物分析方法的公开报道甚少,目前只有Furuta等[17]报道了固相萃取提取狗血中盐酸阿考替胺三水合物,采用高效液相色谱(HPLC)以甲醇-磷酸二氢钾-辛烷磺酸钠为流动相进行测定的方法。该方法使用的离子对试剂辛烷磺酸钠,在流动相中使用时,系统前平衡和后冲洗均需较长时间,因而整个分析过程比较耗时。此外,离子对试剂对pH值比较敏感,配制流动相时要求精确度较高,直接影响了实验的重复性和重现性。

    图  1  盐酸阿考替胺三水合物结构图
    Figure  1.  Structure of acotiamide hydrochloride trihydrate

    HPLC因其快速、准确、测试条件温和等优点,在有机化合物分离、分析中发挥着重要作用。本文拟建立一种更为简单的HPLC方法,通过改变流动相组成(包括流动相种类、有机相比例、缓冲盐浓度)和检测波长来优化色谱条件,实现对盐酸阿考替胺三水合物快速、准确的测定,为盐酸阿考替胺三水合物的合成和提纯工艺质量控制提供可靠的依据。

    Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配有四元泵(包含真空脱气机),自动进样器,智能型柱温箱,二极管阵列检测器(DAD)。

    甲醇、乙腈均为HPLC级,购自Honeywell公司(Honeywell Burdick & Jackson, Muskegon, MI, USA);乙酸铵为分析纯(购自南京化学试剂有限公司,南京);冰乙酸为分析纯(购自国药集团化学试剂有限公司,上海),氨水为分析纯(购自南京化学试剂有限公司,南京);纯净水(购自杭州娃哈哈集团有限公司,杭州)。

    盐酸阿考替胺三水合物对照品(≥99.5%)和粗品均购自南京复兴生物有限公司。

    色谱柱:Ultimate XB-C18柱(4.6 mm × 150 mm, 5 μm)购自月旭材料科技(上海)有限公司;柱温30℃;流动相:甲醇-20 mmol/L乙酸铵水溶液= 45:55(V/V);流速1.0 mL/min;进样量10 μL;检测波长280 nm。

    精确称取盐酸阿考替胺三水合物对照品25 mg于25 mL容量瓶中,以流动相溶解,并定容,配制成1 mg/mL的储备溶液,分别用流动相稀释成0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001、0.0006、0.0005和0.0001 mg/mL的系列标准溶液,待用。

    精确称取盐酸阿考替胺三水合物粗品10 mg于25 mL容量瓶中,以流动相溶解并定容。

    分别用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸铵水溶液、乙腈-乙酸铵水溶液作为流动相。以甲醇-水和乙腈-水分别作为流动相时,盐酸阿考替胺三水合物峰形展宽严重,而以甲醇-乙酸铵水溶液和乙腈-乙酸铵水溶液作为流动相时,样品的保留时间合适且峰形较好,这是由于盐酸阿考替胺三水合物为两性化合物,必须在一定的pH缓冲环境下才能得到好的峰形。考虑甲醇的毒性较乙腈低,且价格较便宜,故选择甲醇-乙酸铵水溶液作为流动相。

    固定其他色谱条件不变,通过改变流动相中甲醇的比例优化盐酸阿考替胺三水合物的分离(见图 2)。从图 2中可以看出,55%甲醇时,杂质1、2重叠在一起并与主峰部分重叠;50%甲醇时,杂质1、2分离虽有改善,杂质2与主峰依然没有完全分离。随着甲醇比例的降低,主峰与杂质峰均得到良好分离,但当甲醇比例下降至40%时,杂质4在50 min时还没有完全出峰;而当甲醇比例降至35%时,50 min内杂质3和4都未出峰。考虑到主峰与杂质峰的分离情况以及合适的分析时间,甲醇比例选择45%为最佳有机调节剂比例。该条件下,盐酸阿考替胺三水合物出峰时间为8 min,总分析时间为23 min,优于文献[17]中报道方法。

    图  2  盐酸阿考替胺三水合物粗品在不同甲醇比例下的色谱图
    Figure  2.  HPLC chromatograms of acotiamide hydrochloride trihydrate products under different methanol ratio

    保持乙酸铵浓度为20 mmol/L不变,用冰乙酸或氨水分别调节其pH值在5.5~7.5之间。考察流动相pH对保留及峰形的影响。结果表明,pH改变对保留时间影响不大,只会影响盐酸阿考替胺三水合物的峰形。当pH在6.5~7.0之间时主峰峰形对称性均良好,本实验选择缓冲溶液的pH为6.8。

    保持其他条件不变,分别配制10、15、20、30、40、50 mmol/L的乙酸铵缓冲溶液(pH 6.8) 进行样品测定,分析结果显示,当缓冲盐浓度小于20 mmol/L时,盐酸阿考替胺三水合物保留不稳定,当缓冲盐浓度在20~50 mmol/L之间时,峰形良好,保留稳定且差异不大,考虑高浓度缓冲盐对色谱柱可能的损伤,故选择缓冲盐浓度为20 mmol/L。

    用二极管阵列检测器在210~400 nm波长下进行扫描,盐酸阿考替胺三水合物的紫外特征吸收波长为220 nm、280 nm和355 nm(图 3),其中,220 nm为末端吸收,甲醇和乙酸铵在此波长下会有较强的背景吸收,而280 nm比355 nm吸收要强,因此选择280 nm为检测波长。

    图  3  盐酸阿考替胺三水合物紫外吸收光谱
    Figure  3.  UV spectrum of acotiamide hydrochloride trihydrate

    以峰面积(A, mμV·s)对标准溶液的质量浓度(ρ, mg/mL)进行线性回归,在0.0006~1.0 mg/mL浓度范围内,盐酸阿考替胺三水合物线性良好,线性回归方程为Y=34.57+17083.72X,相关系数r2=0.9998。其中对浓度为0.002 mg/mL的标准溶液重复进样5次,盐酸阿考替胺三水合物峰面积相对标准偏差(RSD)为0.14%。在3倍信噪比(S/N=3) 时,测得方法的最低检出限(LOD)为0.0002 mg/mL,10倍信噪比(S/N=10) 时,测得方法的定量限(LOQ)为0.0006 mg/mL。

    精确称取盐酸阿考替胺三水合物粗品10 mg于25 mL容量瓶中,以流动相溶解并定容,连续配制五份,每份样品重复进样两次并用外标法进行日内含量测定。以同样方法每天配制一份盐酸阿考替胺三水合物粗品溶液,连续配制5天,进行日间含量测定,测定结果见表 1。日间、日内含量在91.31%~92.68%之间,RSD均小于1%,表明方法具有良好的精密度,适用于盐酸阿考替胺三水合物工业品分析。

    表  1  盐酸阿考替胺三水合物样品测定
    Table  1.  Determination of acotiamide hydrochloride trihydrate in crude samples
    平行样品日内测定含量(%)日间测定含量(%)
    192.0492.19
    291.3192.47
    392.1792.21
    492.0791.46
    592.4792.68
    平均值92.0192.20
    RSD(%)0.460.50
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    针对盐酸阿考替胺三水合物的结构,采用HPLC法对其进行分析测定,主要难点是选择合适的缓冲盐和合适的pH值,提高分析的重复性和可操作性。本研究建立的HPLC方法采用C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱为主流通用柱,以甲醇-乙酸铵水溶液(20 mmol/L,pH 6.8) 作流动相有利于色谱系统的快速平衡。方法稳定、准确度高,易于操作,为盐酸阿考替胺三水合物药物的快速分析提供了基础,可用于盐酸阿考替胺三水合物工业品的检测,并用于原料药的质量控制。

  • 表  1   不同排空时间下石笋标准的碳氧同位素组成

    Table  1   δ13C>and δ18Ocompositions of the stalagmite standard on varied flushing times

    排空时间
    (min)
    δ13CVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    δ18OVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    1~7 存在空气次级峰 存在空气次级峰
    9 -10.740 0.038 -8.567 0.010
    11 -10.784 0.026 -8.480 0.010
    12 -10.774 0.012 -8.563 0.004
    13 -10.798 0.003 -8.574 0.010
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    表  2   不同反应温度下石笋标准的碳氧同位素组成

    Table  2   δ13C and δ18O compositions of the stalagmite standard on varied temperatures

    反应温度
    (℃)
    δ13CVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    δ18OVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    50 -10.785 0.031 -8.588 0.024
    60 -10.726 0.050 -8.629 0.013
    72 -10.758 0.039 -8.550 0.027
    80 -10.811 0.065 -8.577 0.022
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    表  3   不同反应时间下石笋标准的碳氧同位素组成

    Table  3   δ13C and δ18O compositions of the stalagmite standard on varied reaction times

    反应时间
    (min)
    δ13CVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    δ18OVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    30 -10.776 0.009 -8.562 0.036
    45 -10.749 0.046 -8.512 0.006
    60 -10.765 0.036 -8.524 0.009
    75 -10.760 0.011 -8.533 0.044
    90 -10.944 0.036 -8.522 0.027
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    表  4   不同色谱分离温度下石笋标准的碳氧同位素组成

    Table  4   δ13Cand δ18Ocompositions of the stalagmite standard on varied chromatographic separation temperatures

    色谱温度
    (℃)
    δ13CVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    δ18OVPDB
    (‰)
    SD
    (1σ, n=4)
    45 -10.823 0.050 -8.488 0.053
    60 -10.811 0.024 -8.485 0.036
    70 -10.760 0.024 -8.584 0.047
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出版历程
  • 收稿日期:  2014-06-09
  • 修回日期:  2014-10-24
  • 录用日期:  2014-11-14
  • 发布日期:  2014-06-24

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