Optimization of Digestion Conditions in the Kjeldahl Method for Nitrogen Analysis Using Response Surface Methodology
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摘要: 经典凯氏定氮法是通过观察消解反应现象来控制温度和时间，对于数量较多的样品同时消解会耗费大量的人力及时间，因此需要采用合理的试验设计方法确定最佳消解温度和时间，以实现批量消解样品，提高分析效率。本文利用响应曲面法对凯氏定氮法中的消解条件进行了优化分析，选择料液比、消解温度和消解时间作为优化因素，研究三因素的不同水平对氮含量测定的影响。通过响应曲面分析得到最优的消解条件为：料液比(g/mL)=0.3 : 5，消解温度260℃，消解时间60 min。重复实验结果表明，样品在优化的条件下能够很好地消解，重现性较好；标准物质的氮含量的实验测定值(1310×10-6)与标准值(1300×10-6)基本一致，两者的对数误差绝对值为0.003，方法的准确性高。应用响应曲面试验设计方法，对于评价凯氏定氮法中三个消解条件对氮含量的非线性影响起到了很好的优选作用，能更好地预测实验因素对分析结果的影响趋势，可以准确控制消解温度和消解时间，对于提高分析效率具有实用意义。Abstract: Reaction phenomenon has always been observed to control digestion conditions such as temperature and time in classical Kjeldahl method for nitrogen analysis, but it is not suitable for a large number of samples which need a lot of manual labour and time. Therefore it is necessary to optimize digestion conditions for simultaneous digestion of a large number of samples in order to increase efficiency. In this experiment, response surface methodology (RSM) was applied for the optimization of digestion conditions in the Kjeldahl method for nitrogen analysis. In RSM analysis, solid/liquid ratio, digestion temperature and digestion time which affect the determination of nitrogen content were examined. Results show that the optimal parameters were determined as follows: solid/liquid ratio of 0.3 : 5 (g/mL), digestion temperature of 260℃, and digestion time of 60 min. Under the optimized conditions, the calculated value (1310×10-6) and certified value (1300×10-6) of nitrogen content are basically consistent with the absolute value of logarithmic error of 0.003 giving it practical significance. The BBD experiment of digestion condition in Kjeldahl method plays a very good role in optimizing the nonlinear effects of measuring nitrogen content, which can better predict the trend of the impact of experimental factors on the results. The research provided the scientific basis and theory guidance for optimization research of digestion conditions by correctly using RSM. It will speed up analysis and also save time by adjusting the digestion temperature and digestion time accurately.
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氮是土壤多目标地球化学调查中规定定量分析的54种指标中的必测元素。多目标地球化学调查样品分析的显著特点是样品数量多，而传统的测定地质样品中全氮的含量是采用经典的凯氏定氮法[1-2]，凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。目前，普遍采用凯氏定氮法对土壤、食品、农产品、饲料以及一些物质进行蛋白质含量的测定。
运用经典的凯氏定氮法测定样品中氮含量时，需要通过观察来确定消解是否完全，没有确定的消解温度和时间，需要分析人员观察反应现象来判断，耗费人力、时间，对于大批量样品的测定存在一定的困难。因此有必要对凯氏定氮法的消解条件进行优化，包括确定最佳消解温度和时间，便于批量消解，提高分析效率。本文通过选择料液比、温度和时间作为优化因素，采用响应曲面法(Response Surface Method，RSM)研究各因素的不同水平对氮的含量的影响。响应曲面法不同于正交设计的线性模型，是一种多元分析方法，采用该方法可以建立连续变量曲面模型，是一种实验设计的最优化方法[3]。所谓响应曲面法即是将系统的响应作为一个或多个因子的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，根据直觉的观察来选择实验设计中的最优条件，在工艺优化、产品性质研究等方面已有广泛的应用[4-9]，可为试验设计提供科学的理论基础。本文将响应曲面分析的方法应用于优化凯氏定氮法消解条件研究，以利于通过控制各因素，实现氮含量的快速准确测定。
1. 实验部分
1.1 仪器与主要试剂
多孔温控电热板(湖北地质试验研究所)，六联定氮蒸馏装置(中国科学院南京土壤研究所)。
浓硫酸、氢氧化钠溶液(400 g/L)、硼酸溶液(200 g/L)、混合加速剂(硫酸钾+硫酸铜+硒，质量比100 : 10 : 1)、盐酸标准溶液(0.005 mol/L)、甲基红-溴甲酚绿指示剂等。所用试剂均为分析纯，实验用水为无氨水。
1.2 实验样品
本实验所用样品为土壤标准物质GBW 07423，氮标准值w(N)/10-6的不确定度为1300±100。
1.3 实验方法
称取0.1~0.5 g土壤样品于50 mL比色管中，在2 g混合加速剂的共存下，用5 mL浓硫酸煮解氧化，试样中的氮转化为硫酸铵，再加入30 mL氢氧化钠溶液碱化后，加热蒸馏逸出的氨，经硼酸溶液吸收，用盐酸标准溶液滴定并计算出试样中氨的含量[10]。
1.4 响应曲面优化试验设计
根据响应曲面法的设计原理，设计了三因素三水平的响应曲面分析试验，共有15个试验点，变量为称样量与加入硫酸体积之比(料液比，g/mL)、消解温度和消解时间，符号分别表示为x1、x2和x3，响应值为氮的含量w(N)/10-6，符号表示为y，期望获得土壤标准物质GBW 07423的w(N)/10-6标准值时各因素的值。
采用Box-Behnken Design(BBD)建立RSM设计，BBD实验设计是用来评价指标和因素之间的非线性关系的一种实验方法，实验组合数较少，常用于需要对因素的非线性影响进行研究的试验中。试验因素和水平的选值见表 1。
表 1 BBD实验设计的因素水平Table 1. Factors and levels in BBD design因素 符号 水平 平均值x 标准差Δ -1 0 +1 料液比/(g·mL-1) x1 0.1 : 5 0.3 : 5 0.5 : 5 0.3 0.2 消解温度/℃ x2 230 265 300 265 35 消解时间/min x3 30 60 90 60 30 2. 结果与讨论
2.1 响应曲面实验设计结果
以w(N)/10-6为响应值y，根据Design-Expert V8软件，共设置15个试验点，其中12个点为析因点，3个点为零点，零点试验进行3次，以估计误差。采用BBD建立RSM设计，选择二次多项式逐步回归方法[11]，BBD设计及结果见表 2。
表 2 BBD设计及氮含量的实验值和计算值Table 2. BBD matrix,experimental values and calculated values of nitrogen content试验
编号x1 x2 x3 y 实验值 计算值 1 -1 +1 0 1415 1393 2 0 +1 -1 1341 1350 3 0 0 0 1329 1321 4 0 0 0 1317 1321 5 +1 0 +1 1290 1290 6 -1 -1 0 1286 1264 7 0 -1 -1 1117 1126 8 0 0 0 1329 1321 9 0 -1 +1 1235 1242 10 +1 -1 0 1097 1104 11 0 +1 +1 1345 1352 12 +1 0 -1 1253 1231 13 +1 +1 0 1302 1309 14 -1 0 +1 1404 1412 15 -1 0 -1 1327 1353 2.2 模型建立与显著性检验
通过对料液比、消解温度、消解时间三因素进行试验优化设计，对试验数据进行多项式回归，得二次多项式方程：
y=1321.29-61.25x1+83.50x2+29.50x3+19.00x1x2-28.50x2x3-54.04x22(1)
响应曲面分析中对试验结果进行拟合的二次模型方差分析见表 3。由表 3的方差分析结果可见，模型的确定系数R2=0.9758，说明该模型极显著(P＜0.0001)，与实际情况拟合得很好，因此该模型可用来进行响应值的预测，试验设计方案正确。各因素的线性效应皆显著，x2x3的交互影响显著，而x1x2的交互影响不显著。并且由式(1)计算获得的模型计算值与实验测定值进行比较，结果如图 1所示，计算值与实测值之间的差异较小。
表 3 BBD设计的方差分析结果Table 3. Results of variance analysis from stepwise quadratic regression model using BBD design方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 108346 6 18058 53.87 <0.0001 x1 30012 1 30012 89.54 <0.0001 x2 55778 1 55778 166.4 <0.0001 x3 6962 1 6962 20.77 0.0019 x1x2 1444 1 1444 4.308 0.0716 x2x3 3249 1 3249 9.693 0.0144 x22 10901 1 10901 32.52 0.0005 残差 2681 8 335.2 - - 失拟项 2585 6 430.9 8.977 0.1036 纯误差 96 2 48 - - 总和 111027 14 - - - ![]()
图 1 氮含量的实验值与计算值的比较Figure 1. Calculated values vs. experimental values of nitrogen content2.3 最佳消解条件的计算
在料液比取0.3 : 5(g/mL)的情况下，由多元回归方程式所做的消解温度与消解时间交互影响氮的含量的响应曲面图见图 2。对图 2进行分析与评价，以确定最佳因素水平范围，通过计算可得到最佳因素水平z。
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图 2 消解温度与消解时间交互影响氮含量的响应曲面图Figure 2. Response surface graph for reciprocal effect of digestion temperature and digestion time on nitrogen content根据式(1)，令y=1300，求解得(z1，z2，z3)=(0.104，-0.142，-0.0502)。
换算为：
实际值(x1，x2，x3)=(z1Δ1+
1，z2Δ2+ 2，z3Δ3+ 3) =(0.104×0.2+0.3，-0.142×35+265，-0.0502×30+60) =(0.321，260，58.5)
平均值
和标准差Δ值见表 1。 为了便于实际操作及计算简便，将最优条件修正为料液比为0.3 : 5(g/mL)，在260℃下消解60 min，计算氮含量的理论值为1308×10-6，而标准物质GBW 07423氮含量的标准值为1300×10-6，理论上可以很好地满足要求。
2.4 最佳消解条件的验证
将土壤标准物质GBW 07423在确定的优化条件下进行3次验证实验，测得氮含量的平均值为1310×10-6，氮含量的标准值为1300×10-6，测定值与标准值的对数误差绝对值为0.003，结果说明该模型能够较好地反映在该消解条件理论值与计算值之间的关系，实验获得的消解优化条件是可信的。
为了进一步检验响应曲面法所得结果的可靠性，对一些土壤标准物质在优化的消解条件下获得的氮含量测定值与标准值进行比较，对比结果见表 4，其对数误差绝对值均小于0.1，更进一步证明了在优化条件下进行消解得到的结果是可靠的，方法具有普遍的应用意义。
表 4 验证试验的结果对比Table 4. Verification tests of the method土壤标准物质编号 w(N)/10-6 对数误差绝对值 氮含量的标准值与不确定度 氮含量的实验值 GBW 07402 630±59 625 0.004 GBW 07403 640±50 648 0.006 GBW 07404 1000±62 990 0.004 GBW 07405 610±31 636 0.018 GBW 07406 740±59 719 0.013 GBW 07407 660±62 648 0.008 GBW 07408 370±54 389 0.022 GBW 07424 1260±110 1308 0.010 GBW 07425 950±100 1002 0.016 GBW 07426 550±60 566 0.023 GBW 07427 720±90 742 0.012 GBW 07428 810±120 872 0.013 GBW 07429 940±100 1002 0.032 GBW 07430 1020±110 1049 0.028 GBW 07446 106 97 0.037 GBW 07447 273±33 318 0.066 GBW 07448 1030±109 1002 0.012 3. 结语
本实验通过响应曲面试验设计方法，考察了凯氏定氮法中试样料液比、消解温度和消解时间三因素对氮含量测定的影响。二次方程的模型回归显著，且失拟性检验不显著，说明通过本实验所建立的二次回归方程可以反映所考察的三个因素与响应值之间的非线性关系，试验设计科学合理。由回归方程所做的响应曲面图对凯氏定氮法进行分析与评价，从中确定了最佳因素水平范围，通过计算得到的最优条件是：物料比为0.3 : 5(g/mL)，在260℃下消解60 min，在此条件下得到氮的含量实验平均值为1310×10-6，实验值与标准值(1300×10-6)的对数误差绝对值为0.003。将该条件应用于多目标地球化学调查样品氮元素的分析，可以准确控制消解温度和消解时间，提高分析效率，并且测定结果稳定可靠，对于大批次的样品同时测定具有实用意义。
凯氏定氮法包括三个部分：消解反应、蒸馏、滴定。本实验设计中的消解条件涉及料液比、消解温度和消解时间三个因素，而仅仅对消解条件进行优化，实验结果并不能保证完全准确。在实际生产中，消解条件中加入混合加速剂的用量[12]、控制蒸馏过程中蒸汽的流速和酸碱的污染、滴定误差等实验条件对于结果的准确性同样重要，这些条件的优化选择可在以后的工作中继续探索。
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图 1 氮含量的实验值与计算值的比较
Figure 1. Calculated values vs. experimental values of nitrogen content
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图 2 消解温度与消解时间交互影响氮含量的响应曲面图
Figure 2. Response surface graph for reciprocal effect of digestion temperature and digestion time on nitrogen content
表 1 BBD实验设计的因素水平
Table 1 Factors and levels in BBD design
因素 符号 水平 平均值x 标准差Δ -1 0 +1 料液比/(g·mL-1) x1 0.1 : 5 0.3 : 5 0.5 : 5 0.3 0.2 消解温度/℃ x2 230 265 300 265 35 消解时间/min x3 30 60 90 60 30 
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表 2 BBD设计及氮含量的实验值和计算值
Table 2 BBD matrix,experimental values and calculated values of nitrogen content
试验
编号x1 x2 x3 y 实验值 计算值 1 -1 +1 0 1415 1393 2 0 +1 -1 1341 1350 3 0 0 0 1329 1321 4 0 0 0 1317 1321 5 +1 0 +1 1290 1290 6 -1 -1 0 1286 1264 7 0 -1 -1 1117 1126 8 0 0 0 1329 1321 9 0 -1 +1 1235 1242 10 +1 -1 0 1097 1104 11 0 +1 +1 1345 1352 12 +1 0 -1 1253 1231 13 +1 +1 0 1302 1309 14 -1 0 +1 1404 1412 15 -1 0 -1 1327 1353
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表 3 BBD设计的方差分析结果
Table 3 Results of variance analysis from stepwise quadratic regression model using BBD design
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 108346 6 18058 53.87 <0.0001 x1 30012 1 30012 89.54 <0.0001 x2 55778 1 55778 166.4 <0.0001 x3 6962 1 6962 20.77 0.0019 x1x2 1444 1 1444 4.308 0.0716 x2x3 3249 1 3249 9.693 0.0144 x22 10901 1 10901 32.52 0.0005 残差 2681 8 335.2 - - 失拟项 2585 6 430.9 8.977 0.1036 纯误差 96 2 48 - - 总和 111027 14 - - -
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表 4 验证试验的结果对比
Table 4 Verification tests of the method
土壤标准物质编号 w(N)/10-6 对数误差绝对值 氮含量的标准值与不确定度 氮含量的实验值 GBW 07402 630±59 625 0.004 GBW 07403 640±50 648 0.006 GBW 07404 1000±62 990 0.004 GBW 07405 610±31 636 0.018 GBW 07406 740±59 719 0.013 GBW 07407 660±62 648 0.008 GBW 07408 370±54 389 0.022 GBW 07424 1260±110 1308 0.010 GBW 07425 950±100 1002 0.016 GBW 07426 550±60 566 0.023 GBW 07427 720±90 742 0.012 GBW 07428 810±120 872 0.013 GBW 07429 940±100 1002 0.032 GBW 07430 1020±110 1049 0.028 GBW 07446 106 97 0.037 GBW 07447 273±33 318 0.066 GBW 07448 1030±109 1002 0.012
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