总大肠菌群(Total Coliform)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)是指示水体中粪便污染的最重要的两个细菌学指标。总大肠菌群主要由以下4个菌属细菌组成：埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属。与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希氏菌，而柠檬酸菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属所占数量较少。这些菌属可以在人和畜的粪便中检出，也可以在营养丰富的水体中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出这些细菌的可能性。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希氏菌检出的意义最大，总大肠菌群的检出意义略差一些^[1]。因此，对一般的环境水样可先检测总大肠菌群的存在与否，再进而根据需要检测大肠埃希氏菌。对这两个指标的检测，国内的主要水质标准，如《水和废水监测分析方法》第四版只收录了多管发酵法和滤膜法^[2]，目前已经十分落后；而2006版《生活饮用水标准检验方法》虽然新增了能够快速测定的固定酶底物法(Defined Substrate Technology)，但是由于配套耗材成本较高，在基层检测实验室的推广有一定难度^[3]。目前国内大部分日常检测还是使用原有的国标方法——远藤琼脂法，这是一种以远藤琼脂作为主要培养介质的滤膜法，其最大的缺点是检测周期长，操作繁琐，方法的干扰因素多，方法性能不是十分理想。MI琼脂法的出现使解决这些问题成为可能，该法已经得到美国国家环保署(EPA)的认可，是EPA检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的首选方法^[4]。

酶底物技术(Enzyme Substrate Technique)是一种可以快速评价水中总大肠菌群或大肠埃希氏菌的检测技术。该检测技术利用了目标菌群在选择性培养基上产生特异性的酶类物质，进而分解可以起到指示作用的底物来达到检测目的^[5]。此类选择性培养基亦被称为显色培养基(Chromogenic/Fluorogenic Culture Media)。显色培养基结合了酶与底物反应的特异性和菌落颜色的可视化信息，可以在自然环境中检测和鉴定不同的微生物个体,尤其是对混合生长的多种微生物进行检测，因此被广泛应用于不同微生物群落结构检测和评价,是微生物快速检测方法中的研究热点^[6]。

目前，能较好地应用于水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测的显色培养基主要有mTEC琼脂和MI琼脂两种。其中mTEC琼脂法只能检测大肠埃希氏菌单个指标，而MI琼脂法能同时检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌两个指标，显然具有更好的工效^{[7, 8]}。MI琼脂是一种含有MUGal(4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷)和IBDG(吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸)两种底物的显色培养基。总大肠菌群和大肠埃希氏菌在MI琼脂培养基上能够分别产生分解MUGal和IBDG这两种底物的酶类物质——β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶。MUGal被总大肠菌群分解后，能够在365 nm紫外光照射下产生荧光，同时，大肠埃希氏菌能够分解IBDG，在MI琼脂上产生蓝色的菌落^[9]。

由于MI琼脂法和远藤琼脂法的过滤操作步骤相同，且结果均以CFU/100 mL表达,所以本文运用MI琼脂法和国家标准方法——远藤琼脂法同时检测环境水样中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌，从两种方法的灵敏度、特异性、检测结果等效性等方面进行数据分析比较，验证MI琼脂法的技术优势，为该技术在国内的推广应用提供参考依据。

1.   实验部分

1.1   仪器与设备

恒温培养箱(35℃)，紫外检测仪(美国Spectroline公司，功率6 W，波长365 nm)等。

1.2   材料

MI琼脂培养基(美国BD公司)：用于MI琼脂法检测。

远藤琼脂培养基、NA-MUG培养基、乳糖蛋白胨培养基等：用于远藤琼脂法检测。

BioBall^®总大肠菌群定量质控菌株：产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，生物梅里埃公司,菌含量为(30±3) CFU/100 mL，用于总大肠菌群回收率试验。

BioBall^®大肠埃希氏菌(Escherichia coli)定量质控菌株：生物梅里埃公司,菌含量为(30±3) CFU/100 mL，用于大肠埃希氏菌回收率试验。

其他材料：醋酸纤维素酯滤膜(0.45 μm孔径)，革兰氏染色试剂盒，生理盐水等。

1.3   两种检测方法实验步骤

1.3.1   MI琼脂法

使用经过灭菌处理的微孔滤膜(孔径为0.45 μm)过滤100 mL水样,细菌被截留在滤膜上,将滤膜贴在MI琼脂培养基上,35℃培养24 h后，在365 nm紫外光下产生白色荧光的菌落为总大肠菌群，在常光下显蓝色的菌落为大肠埃希氏菌，未产生荧光的蓝色菌落一并计入总大肠菌群，最终结果用CFU/100 mL表达^[9]。

1.3.2   远藤琼脂法

实验步骤参照《生活饮用水标准检验方法》总大肠菌群和大肠埃希氏菌滤膜法检测步骤^[10]。使用经过灭菌处理的微孔滤膜(孔径为0.45 μm)过滤100 mL水样，细菌被截留在滤膜上,将滤膜贴在远藤琼脂培养基上,36℃培养24 h后，计数具有金属光泽的紫红色菌落，对此类菌落进行革兰氏染色和乳糖蛋白胨复发酵试验，若结果均为阳性则判定为总大肠菌群阳性菌落。若将远藤琼脂上培养24 h的滤膜转移至NA-MUG培养基上，再培养4 h，在365 nm紫外光下产生荧光的菌落即为大肠埃希氏菌。

1.4   回收率试验和地表水样品检测步骤

1.4.1   加标样品

准备20件生活饮用水样品，将BioBall^®水溶性干粉菌株溶解于相应体积的饮用水样中，混匀样品^[11]。分别使用MI琼脂法和远藤琼脂法对加标水样进行总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测，检测方法分别等同于1.3.1节和1.3.2节，每个样品平行测定三次，取平均值计算其回收率。

1.4.2   地表水样品

准备30件地表水样品，同时使用MI琼脂法和远藤琼脂法检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌。检测方法分别等同于1.3.1 节和1.3.2节。使用Excel软件对两组检测结果进行相关性和一致性检验。

2.   MI琼脂法和远藤琼脂法的比较

2.1   方法精密度比较

通过定量菌株的加标回收试验可以间接显示MI琼脂法和远藤琼脂法的灵敏度差异。所得平均回收率占优的方法具有较好的灵敏度。

20件加标样品的总大肠菌群回收率测试结果如图 1所示，使用MI琼脂法和远藤琼脂法的平均回收率分别为89.2%和81.0%。20件加标样品的大肠埃希氏菌回收率测试结果如图 2所示，使用MI琼脂法和远藤琼脂法的平均回收率分别为88.8%和81.2%。可见MI琼脂法对目标菌的检出率总体上要高于远藤琼脂法，方法灵敏度更佳。

图  1  总大肠菌群回收率试验结果

Figure  1.  Results of recovery test for total coliforms

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图  2  大肠埃希氏菌回收率试验结果

Figure  2.  Results of recovery test for Escherichia coli

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2.2   水样的检测结果比较

2.2.1   总大肠菌群

根据图 3拟合的曲线所示，MI琼脂法和远藤琼脂法同时检测地表水中总大肠菌群的相关系数达到了0.9627，具有直线回归关系。相关系数t检验:t=18.841,P<0.05。检验结果表明，MI琼脂法和远藤琼脂法检测总大肠菌群的结果具有显著的相关性。同时，对图 3的两组检测结果进行一致性检验，t检验:t=1.641<t_0.05/2,29=2.045(P>0.05,α=0.05),显示MI琼脂法和远藤琼脂法同时检测检测总大肠菌群的结果没有统计学意义上的差异。相关性和一致性检验结果证明，两种方法检测总大肠菌群具有等效性。

图  3  地表水样检测总大肠菌群结果

Figure  3.  Detection results of surface water samples for total coliforms

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2.2.2   大肠埃希氏菌

根据图 4拟合的曲线所示，MI琼脂法和远藤琼脂法同时检测地表水中大肠埃希氏菌的相关系数达到了0.9511，具有直线回归关系。相关系数t检验:t=16.292,P<0.05。检验结果表明，MI琼脂法和远藤琼脂法检测大肠埃希氏菌的结果具有显著的相关性。同时，对图 4中两组检测结果进行一致性检验，t检验:t=1.893<t_0.05/2,29=2.045(P>0.05,α=0.05),显示MI琼脂法和远藤琼脂法同时检测检测大肠埃希氏菌的结果没有统计学意义上的差异。相关性和一致性检验结果证明，两种方法检测大肠埃希氏菌具有等效性。

图  4  地表水样检测大肠埃希氏菌结果

Figure  4.  Detection results of surface water samples for Escherichia coli

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3.   MI琼脂法的技术优势

保证微生物安全是世界各国制定生活饮用水卫生标准遵循的第一原则^[12]。就目前的水质安全形势而言，细菌学应急检测的需求将会越来越大，这就要求新的检测方法必须尽量缩短检测周期，提高方法的特异性和可操作性，并能够有效控制检测成本，减轻实验室的资金负担。与传统的国标检测方法(远藤琼脂法、酶底物法)相比，MI琼脂法还具备了以下独特优势。

3.1   检测周期较传统方法大大缩短

MI琼脂法操作简便，检测周期短，可同时检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌两个指标，大大提高了检测效率。表 1归纳了4种方法检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测周期，其中以多管发酵法的检测周期最长，远藤琼脂法次之，固定酶底物法和MI琼脂法的检测周期最短。传统的多管发酵法和远藤琼脂法，若有阳性检出则需要进行平板划线分离、革兰氏染色和多管复发酵的验证步骤，操作过程十分繁琐，不易掌握。而MI琼脂法的检测周期仅需24 h，只需滤膜过滤操作即可，无需验证步骤，易于操作人员掌握。

表  1  检测周期比较结果

Table  1.  Comparison of detection period

检测方法	总大肠菌群检测周期/h	文献	大肠埃希氏菌检测周期/h	文献
多管发酵法	72	[10]	48	[10]
远藤琼脂法	48	[10]	24+4	[10]
MMO-MUG酶底物法	24	[10]	24	[10]
MI琼脂法	24	[9]	24	[9]

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3.2   检测结果的现象较远藤琼脂法更为明显

MI琼脂法相对于传统的远藤琼脂法，检测结果现象明显，方法干扰小^[13]。由于总大肠菌群在远藤琼脂上的阳性特征是带有金属光泽的淡红色到紫红色菌落，在遇到高浊度或者较为复杂的水样时，其阳性特征与淡红色的培养基背景色区分度不高，其金属光泽亦容易被滤膜上富集的颗粒物所掩盖，影响了计数的准确性^[14]。而MI琼脂中的两种酶底物可以使总大肠菌群菌落在365 nm紫外光下产生荧光，同时使大肠埃希氏菌产生蓝色的菌落，与培养基的背景色区分十分明显。相比之下，MI琼脂法更有利于阳性菌落的精确计数^[15]。

3.3   检测成本远低于酶底物法

相比于国标收录的MMO-MUG酶底物法，MI琼脂法既兼具了酶底物技术的先天优势，又极大地控制了检测成本。MMO-MUG酶底物法因为需要使用多孔定量盘等配套耗材，单个样品的检测成本在￥30.0左右。而一瓶500 g的MI琼脂成品干粉培养基售价大约是￥2200，可以配制倾倒大约900块MI琼脂平板，每块平板的成本不足2.5元，单个样品的检测成本远低于MMO-MUG酶底物法。

3.4   方法的特异性较MMO-MUG酶底物法有优势

MI琼脂法特异性高。根据国外对MI琼脂法和MMO-MUG酶底物法有关假阳性率和假阴性率的测试报告，除了总大肠菌群的假阴性率，MI琼脂法要高于MMO-MUG酶底物法，其他结果均低于MMO-MUG酶底物法^{[16, 17, 18]}，具体数据见表 2。相比之下，MI琼脂法总体上具有优势。

表  2  假阳性率和假阴性率比较结果

Table  2.  Comparison of false-positive and false-negative

检测方法	假阳性率/%			假阴性率/%
	总大肠菌群	大肠埃希氏菌		总大肠菌群	大肠埃希氏菌
MI琼脂法	6.9	4.3		6.2	4.3
MMO-MUG酶底物法	7.4	9.6		3.5	6.3

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4.   结语

传统的细菌学检测方法因为较长的检测周期和繁琐的验证步骤，在实际应用中已经难以改进。随着酶底物技术和荧光检测技术的发展，显色培养基被越来越多的被应用于水中各类细菌的检测，MI琼脂便是其中之一^{[19, 20]}。本文通过MI琼脂法和远藤琼脂法定量菌株回收率试验以及两种方法同步检测地表水样比较，对MI琼脂法的方法性能进行了基本的测试，其方法的灵敏度以及和国家标准方法的等效性能够保证环境水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测结果的可靠性。MI琼脂法是一种具有快速、简便、抗干扰强等优异性能和成本控制较为理想的检测方法，在将来可以完全替代国家标准方法中传统的滤膜法，推广为检测环境水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的日常检测方法。

本文测试的水样种类有一定的局限性，缺乏对一些复杂水样的测试，如工业用水和重度污染的废水等。MI琼脂法是否适用于整个水质检测领域，需要开展进一步的研究。