Contrastive Study of Sample-pretreatment Effects on Analytical Results of Inorganic Carbon Isotopes in Water Sample
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摘要: 水中溶解性无机碳(DIC)的碳同位素前处理方法由传统的BaCl2沉淀法，逐步发展到野外采样后直接通过连续流系统(GasBench-IRMS)测试。当前对于BaCl2沉淀法和连续流测试结果的差异，以及最佳DIC的前处理方法均需要开展深入研究。本文应用BaCl2沉淀法、医用无菌高密度聚乙烯瓶装样、GasBenchⅡ顶空样品瓶野外直接生成CO2气体三种前处理方法，对比研究前处理方法对采自桂林盘龙洞洞穴滴水和地下河水样中DIC碳同位素测试的影响。结果表明，由于BaCl2沉淀法使水样中游离CO2逸出，导致测定的DIC碳同位素值相对于另两种方法均偏正：地下河水样的碳同位素值最大偏正0.26‰；洞穴滴水的碳同位素值最大偏正0.33‰。因为野外水样采集环境的温度、大气压强与实验室内部环境变化较小，没有引起CO2、HCO-3的溶解度改变，用医用无菌高密度聚乙烯瓶和GasBenchⅡ顶空样品瓶采集水样的碳同位素测试结果相同；相对而言，利用GasBenchⅡ顶空样品瓶直接产生CO2气体，能够避免外界环境条件变化导致CO2、HCO-3的溶解度发生变化引起碳同位素分馏，是精确测定水中DIC碳同位素最佳的前处理方法。Abstract: The pretreatments for the measurement of dissolved inorganic carbon (DIC) isotopes in field water samples were developed from traditional BaCl2 precipitation methods to directly continuous flow (GasBench-IRMS) methods. Further research needs be conducted to distinguish the difference between the traditional BaCl2 precipitation methods and the continuous flow (GasBench-IRMS) method in order to select the best pretreatment for DIC. This study compared the results obtained by three pretreatment methods: BaCl2 precipitation, medical sterile high-density polyethylene bottles and acidification of the sample in GasBench headspace vials in field work. Drip water and underground water samples were collected from Panlong cave in Guilin. The results show that because of CO2 escape from the water sample, by using the BaCl2 precipitation the value of the carbon isotope was more positive than other sample-pretreatment methods. The maximum deviation of the carbon isotope value from the underground river is 0.26. The maximum deviation of the carbon isotope value from the cave drip water is 0.33. The temperature and atmospheric pressure are similar in the field and the laboratory, therefore it did not cause solubility change of CO2 and HCO-3 in water samples. The DIC results of the medical sterile high-density polyethylene bottles and GasBench headspace vials are the same. The GasBench headspace vials pretreatment method can effectively avoid the solubility change of CO2 and HCO-3 caused by environmental changes, which leads to the CO2 escape from the water sample or dissolved into the water sample from the atmosphere of CO2. This change may cause carbon isotopic fractionation in DIC of water samples. Using GasBench headspace vials, which directly produce and collect CO2 gas in the field is the recommended DIC pretreatment method.
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随着大气中CO2浓度从1750年的280×10-6逐渐上升到2005年的380×10-6[1]，使得的环境问题中碳循环和温室气体(CO2、O3、N2O、CH4)问题更为突出。全球碳循环主要是指碳在岩石圈、水圈、气圈和生物圈之间不同形态之间的相互转换和运移。在全球碳循环的研究中，随着岩溶地区碳“汇”和“源”的研究逐步深入[2-3]，发现在岩溶作用下产生溶解性无机碳(Dissolved Inorganic Carbon，以下简称DIC)并存储于水体中，具有碳“汇”效应[4-5]。DIC是整个碳循环的一个重要组成部分。在整个过程中水、大气和基岩相互作用主要方程式可以简化为：
(1)气与水相互作用：
CO2(g)+H2O(aq)→ H2CO3(aq)
(2)水与岩相互作用：
H2CO3(aq)+CaCO3(s)→2HCO3-(aq)+Ca2+(aq)
大气CO2溶于水体后在水体中形成DIC的存在形式分别为：CO2、H2CO3、HCO3-、CO32-等主要形态平衡混合物。由于pH值控制着水体中DIC不同形态所占的比例，在pH值为7～9时，水体中的DIC主要是以HCO3-的形式存在[4]。随着碳稳定同位素分析精度的提高，研究水循环中不同形态碳及测定同位素能够揭示碳“源”、“汇”以及碳通量等问题[6-9]。最初测试水体中DIC的前处理方法主要是BaCl2沉淀法[10]，通过将液体样品中DIC转化为固体样品来测试沉淀物(碳酸盐)的碳同位素值，但已经有学者指出BaCl2沉淀法在快速沉淀过程中存在着同位素分馏[11]。Matthews等[12]开发研究了以惰性气体为载气携带测试气体进入质谱仪的高真空室离子源室。随着这种测试技术的发展和完善，美国Thermo Fisher公司研发了水体中DIC的碳同位素分析的前处理装置GasBench。该装置能够直接测定水中DIC的碳同位素，具有准确度高、分析速度较快等特点，已经在国内实验室得到广泛的应用[13-16]。为了准确测定水体DIC中极易逸出的游离CO2，我国研究人员针对其特点提出了准确的测试方法[17]，并且对室内测试DIC含量和碳同位素的方法都进行了详细研究[18]，但是并没有指出如何解决野外样品前处理过程对水体中所有DIC引起的碳同位素分馏。
水体中DIC是全球碳循环中的重要研究对象，因此能够精确地分析测定水中的DIC碳同位素，对于探究碳在水圈中的运移、循环机制等都具有十分重要的科学意义。本文对现有水体中DIC碳同位素测试的三种前处理方法(BaCl2沉淀法、医用无菌高密度聚乙烯瓶装样、GasBenchⅡ顶空样品瓶野外直接生成CO2气体)进行定量对比分析，研究不同前处理方法对水体中DIC的测试结果的影响和引起的碳同位素分馏大小，以寻求建立一套操作简单、准确测定水体中DIC碳同位素的前处理方法。
1. 实验部分
1.1 水样的采集和水样理化性质测定
为了能够对比前处理方法对DIC的影响，本次研究选择不同浓度的DIC样品进行对比，采集桂林地区盘龙洞洞穴滴水和地下河天窗样品。桂林市地处于低纬度地区，湘桂走廊南端，东经109°36'至111°29'，北纬24°15'至26°23'，平均海拔150 m。该地区属于亚热带季风气候，四季分明，雨量充沛，夏季的季风降水主要受到夏季风的影响，年均气温19.5℃，年均降水量1868 mm[19]。
盘龙洞处于桂林市南部38 km处的报安村(如图 1所示)，所处为典型的亚热带温润地区岩溶峰丛洼地。洞穴围岩为上泥盆统融县组(D3r)灰岩，灰岩质纯，局部有页岩夹层。洞穴内年均气温19.5℃，洞穴滴水的水温为19.3～21.2℃，洞穴空气的相对湿度为90%～98%[20]。在野外使用Merck碱度试剂盒滴定地下河天窗(样品编号P地)和洞穴滴水(样品编号P6)的HCO3-浓度；使用WTW Multi 3420多参数水质分析仪现场测定采集水样的pH值和温度；使用testo 435-2多功能测量仪检测样品，采集周围环境的大气压强值。在实验室测试样品时，使用testo 435-2多功能测量仪现场测量环境温度和大气压强，结果列于表 1。
表 1 野外水样HCO3-、pH、温度和实验室温度、压强测量结果Table 1. The measurement results of HCO3-,pH,temperature in field samples and the temperature and pressure in laboratory样品编号 HCO3-浓度
c/(mmol·L-1)pH值 温度
θ/℃大气压
p/PaP地 4.1 7.28 19.5 995.9 P6 7.1 7.85 17.8 995.9 实验室 - - 18.5 998.2 1.2 水样的前处理
1.2.1 BaCl2沉淀法
用于采集样品的600 mL聚乙烯瓶用稀盐酸浸泡24 h后，用超纯水(Mill-Q advantage A10超纯水机纯化，电阻率18.2 MΩ·cm，下同)洗净烘干，备用。在野外采集样品时先用水样冲洗样品瓶三次，加入200 mL左右过滤后的水样，再加入6 mL的2 mol/L NaOH溶液(用市售纯度 > 96%的分析纯NaOH粉末配制)至pH=12后继续加入过量的BaCl2粉末(市售分析纯，纯度 > 99.5%)，最后再加满水样用parafilm封口膜密封。野外采集P地和P6样品(含平行样品)总共4份避光保存带回实验室处理。带回实验室的δ13CDIC野外水样在低温中静置24 h后迅速过滤、烘干，得到不纯的BaCO3样品。
1.2.2 医用无菌高密度聚乙烯瓶装样
市售医用无菌25 mL聚乙烯瓶，用稀盐酸浸泡24 h后，用超纯水洗净烘干，备用。在野外采集样品时先用水样润洗三次，采集的同时加入HgCl2来淬灭水中微生物。装样时尽量避免样品瓶中有气泡，同时用parafilm封口膜密封瓶口。野外采集P地和P6样品(含平行样品)总共4份，避光保存，带回实验室低温保存以备测试。
1.2.3 GasBenchⅡ顶空样品瓶装样
GasBenchⅡ顶空样品瓶和1 mL医用注射器均用稀盐酸浸泡24 h后，用超纯水洗净烘干，备用。顶空样品瓶放入GasBenchⅡ样品盘中利用自动进样器加入脱水100%的磷酸(德国Merck公司)。为了避免排空时间较偏短导致的顶空瓶内残余空气中的CO2和排空过程中外部空气少量回流对测试结果的影响[21]，因此在加入脱水100%磷酸后用高纯He气(纯度 > 99.999%)吹扫540 s。在野外样品采集时先用水样润洗注射器三次后，取600 μL样品缓慢注射至顶空样品瓶内，注射样品时避免样品受瓶内气压影响喷至顶空样品瓶盖口导致测样时将水汽带入测试系统。野外采集P地和P6样品(含平行样品)总共4份带回实验室测试。顶空样品瓶带回实验室后在平衡18 h后开始测量。
1.3 水样溶解性无机碳同位素检测
碳同位素测试仪器为GasBenchⅡ-IRMS系统(美国Thermo Fisher公司)。GasBenchⅡ前处理装置包括：GC-PAL自动进样器；PoraPlot Q色谱柱(25 m×0.32 mm)；恒温样品盘(控制温度±0.1℃)。IRMS为MAT-253同位素质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)。
δ13C分析计算公式为：
水样和粉末沉淀物样品的碳同位素测试结果均为相对于V-PDB标准，水样品和粉末沉淀物的碳同位素分析精度小于0.2‰。为了避免人为因素所产生的误差对实验结果造成影响，每个样品均有平行对比样品。平行对比样品测试数据均有较好的重现性。所有样品均由中国地质科学院岩溶地质研究所测试中心测定。
2. 结果与讨论
2.1 前处理方法测试结果对比
所有水样的DIC的碳同位素测试结果列于表 2。通过BaCl2沉淀法测定不纯BaCO3粉末的碳同位素，P地为-14.30‰，P6为-16.06‰，平行样品之间的测试结果偏差小于0.06‰。医用聚乙烯瓶采集水样测定的DIC的碳同位素P地为-14.54‰，P6为-16.39‰，平行样品之间的测试结果偏差小于0.03‰。顶空样品瓶采集水样的DIC的碳同位素P地为-14.61‰，P6为-16.41‰，平行样品之间的测试结果偏差小于0.06‰。
表 2 不同前处理方法的碳同位素分析结果Table 2. Analytical results of carbon isotope determined with different sample pretreatment methods样品编号 δ13CV-PDB/‰ BaCl2沉淀法 医用聚乙烯瓶采样 顶空样品瓶采样 P地 -14.30 -14.54 -14.67 P地-平行样品 -14.36 -14.52 -14.61 P6 -16.06 -16.39 -16.41 P6-平行样品 -16.05 -16.36 -16.39 本次研究所采集的两种岩溶区域富含DIC的水样的测试结果分布图如图 2所示。图 2数据分布指示了医用聚乙烯瓶和顶空样品瓶采集样品测试的DIC碳同位素值均有良好的重现性，并且两种前处理方法的重现性偏差均小于0.1‰；而BaCl2沉淀法测定的碳同位素值明显偏正于后两种处理方法：地下河样品(P地)碳同位素值偏正0.24‰，平行样品偏正0.26‰；洞穴滴水样品(P6)的碳同位素值偏正0.33‰，平行样品偏正0.29‰，主要由于沉淀法前处理过程中只是将水体中碳同位素值相对偏重的HCO3-和CO32-沉淀，水体中碳同位素值相对偏轻的游离CO2脱气逸出。已有学者指出DIC中游离CO2的碳同位素值明显偏负于水中剩余成分DIC的碳同位素值[17]，为本次研究的BaCl2沉淀偏正于其他的前处理方法提供了实验数据支持。
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图 2 不同前处理方法测试的碳同位素分布图Figure 2. Carbon isotope distribution with different sample pretreatment methodsBaCl2沉淀法中加入NaOH溶液使得HCO3-转化为CO32-便于沉淀，这种方法使得水中DIC平衡方程式：CO2+H2O↔H2CO3↔H++HCO3-↔2H++CO32-的动态平衡破坏，CO2、HCO3-的溶解度发生改变，导致相对富集12C的溶解性游离CO2逸出，或大气中相对富集13C的CO2溶解进入水体，引起碳同位素分馏。
2.2 水体中DIC碳同位素最佳前处理方法的确定
通过对比三种前处理方法的碳同位素结果显示，BaCl2沉淀法明显偏正于医用聚乙烯瓶和顶空样品瓶采集水样方法。由此可见，BaCl2沉淀法引起了岩溶水体中相对富集12C的溶解性游离CO2逸出，使得DIC的碳同位素测试结果偏正。由于医用聚乙烯瓶采集的水样带回实验室及时测试，并且野外水样采集环境的温度与实验室的温度仅仅相差1℃，大气压强的差异也仅为2.3 Pa，在短时间存于细微改变的外界环境中并未引起CO2、HCO3-的溶解度发生变化。但是，如果实验室环境温度(例如夏季和冬季采集样的样品，温差超过10℃)和大气压强相对于野外样品采集环境发生较大改变时，肯定会导致医用聚乙烯瓶开盖的瞬间水中CO2、HCO3-的溶解度改变,发生脱气作用，引起碳同位素分馏。由此可见，针对不同季节的样品采集，医用聚乙烯瓶采集水样并不是最好的前处理方法。
上述研究表明，医用聚乙烯瓶和顶空样品瓶采集样品都能满足DIC碳同位素的测试要求。顶空样品瓶在野外将样品在高纯氦气的背景下酸化，使DIC全部组分转化为CO2气体，以免采集、运输、保存过程中由于人为操作等多种外界因素影响各组分的动态平衡导致的同位素分馏；并且，顶空样品瓶为硼硅玻璃制成，能防止游离和酸化生成的CO2气体在采集、运输、保存过程中通过样品瓶壁“渗出”所引起的同位素分馏。可见，用顶空样品瓶采集水样的方法能够避免由于外界环境条件变化引起CO2、HCO3-的溶解度发生改变，避免发生CO2逸出或大气中CO2溶解入水体引起碳同位素分馏，因此最佳的水样前处理方法是利用GasBenchⅡ顶空样品瓶直接产生CO2气体，可为高分辨率监测水体中DIC的碳同位素变化提供精确的前处理方法。
3. 结语
通过对比传统BaCl2沉淀法、医用无菌高密度聚乙烯瓶、GasBenchⅡ顶空样品瓶装样的DIC碳同位素前处理方法的实验数据，综合分析总结出以下结论。
(1) 对于pH值在7～8，HCO3-浓度在4～7 mmol/L的岩溶水体，传统BaCl2沉淀法的测试结果明显偏正于医用无菌高密度聚乙烯瓶装样品、GasBenchⅡ顶空样品瓶直接产气的测试结果。地下河(P地)和洞穴滴水(P6)的碳同位素值分别偏正0.26‰、0.33‰，主要是由于水中相对富集12C，溶解性游离CO2逸出，使得BaCl2沉淀法测试结果相对偏于其他前处理方法。
(2) 应用GasBenchⅡ顶空样品瓶采集样品，能够避免外界环境条件变化导致CO2、HCO3-的溶解度发生变化所引起的碳同位素分馏，确保测试结果的准确性。GasBenchⅡ顶空样品瓶直接产生CO2气体，能够高分辨率监测水中DIC的碳同位素变化，精确地反映其时间演化规律。
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图 2 不同前处理方法测试的碳同位素分布图
Figure 2. Carbon isotope distribution with different sample pretreatment methods
表 1 野外水样HCO3-、pH、温度和实验室温度、压强测量结果
Table 1 The measurement results of HCO3-,pH,temperature in field samples and the temperature and pressure in laboratory
样品编号 HCO3-浓度
c/(mmol·L-1)pH值 温度
θ/℃大气压
p/PaP地 4.1 7.28 19.5 995.9 P6 7.1 7.85 17.8 995.9 实验室 - - 18.5 998.2 
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表 2 不同前处理方法的碳同位素分析结果
Table 2 Analytical results of carbon isotope determined with different sample pretreatment methods
样品编号 δ13CV-PDB/‰ BaCl2沉淀法 医用聚乙烯瓶采样 顶空样品瓶采样 P地 -14.30 -14.54 -14.67 P地-平行样品 -14.36 -14.52 -14.61 P6 -16.06 -16.39 -16.41 P6-平行样品 -16.05 -16.36 -16.39
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