溶解有机碳(Dissolved organic carbon，DOC)通常是研究海洋、河流和水库等水体生物地球化学循环中物质来源和迁移转化的重要指标^［1-3］。随着对岩溶碳循环过程研究的不断深入，研究者发现岩溶区具有巨大的固碳潜力，是全球碳循环的重要组成部分^［4-6］。在岩溶流域水体中，存在颗粒无机碳、颗粒有机碳、溶解有机碳和溶解性无机碳在水体内部相互转化，其中DOC是水体中有机碳的主要存在形式。DOC在岩溶流域水体中的含量虽然相对较低，但在碳循环和生物地球化学过程中扮演着重要角色。在岩溶流域中，低DOC含量可能限制了微生物对有机物的利用，影响DOC的循环。因此，了解这些转化过程对于评估岩溶流域碳循环及其对全球碳收支的贡献至关重要^［7-9］。特别是，岩溶区水体生态系统中DOC可以通过微生物的作用转化为其他形式的碳，这些转化过程有助于维持生态系统中碳的动态平衡，进而对碳汇的稳定性发挥关键作用^［10-11］。通过分析溶解有机碳的碳同位素值(δ¹³C_DOC)可以指示岩溶水体中的多种形态碳之间的相互转化，可以更深入地理解岩溶碳汇的过程和机理^［12-14］，进而有效地揭示岩溶流域碳的来源及其对碳循环的贡献率^［15-16］。

随着稳定同位素测试技术的持续进步，针对海洋、地表河流等环境中δ¹³C_DOC值的测试方法日益成熟^［17-18］。现阶段δ¹³C_DOC测试方法主要包括三个步骤：①样品过滤、酸化和去除产生CO₂的过程；②将样品中的DOC氧化转化成CO₂气体；③对CO₂气体进行检测分析。在第二步中，将DOC转化为CO₂的方法主要有高温氧化法和湿氧化法。其中湿氧化法是通过添加酸处理水样，将其中无机碳转化为CO₂并排出，以消除无机碳的干扰。之后，向样品中加入氧化剂，在一定的温度条件下，水中DOC被氧化成CO₂。元素分析仪与气体同位素质谱联用(EA-IRMS)的高温氧化法要求将酸处理后的DOC水样冷冻干燥成固体进行测试，样品中含碳量需达到几十微克至一毫克碳^［19-20］。该方法对样品前处理的要求较高，需要严格操作以确保分析结果的准确性和可靠性。有研究者对元素分析仪进样系统、氧化炉、检测器和数据采集软件进行改造，使其能够测定含碳量比传统方法少三个数量级的样品，只需41nmol的碳就能保证分析精度优于1.0‰^［21］。另一种方法是通过激光烧蚀冷冻干燥后的小颗粒样品，产生CO₂进行分析，该方法仅需65ng的碳^［22］。但这些方法都需要将几升的样品过滤、浓缩至1～2mL，前处理流程耗时且样品需求量大。同时，高温氧化法产生的空白值较高，对低含量样品的影响较大，且需要专门的仪器和耗材^［23］。因此，高温氧化法在δ¹³C_DOC测试中效率较低，需要配备多套外围设备，成本高，技术复杂，难以在日常测试中普及。近年来，总有机碳分析仪与稳定同位素质谱仪联用技术(TOC-IRMS)开始得到应用。这种方法在线酸化处理水样后，将其注入高温富氧的总有机碳分析仪氧化管中，将水体中的DOC转化为CO₂，随后由载气引入，经过纯化、干燥和富集，最终进入稳定同位素质谱仪进行分析测试^［3］。这种改进方法能够全自动测定海洋和淡咸水样品中的δ¹³C_DOC值，并且具有全自动操作和高通量测定的优势^［24-25］。然而，该分析系统主要针对水体中DOC、TOC含量和δ¹³C值，测试指标相对单一，且实验成本较高，这些因素限制了该方法在实验室中的广泛应用。因此研究者也在不断探索新的方法和技术，以克服现有的限制，提高分析效率和经济适用性。

现阶段的湿氧化法经过不断地改进和优化前处理条件，已经具备运行成本低、操作简便和完全自动化的特点。后续研究者将湿氧化法处理后的样品与气体同位素质谱仪联用技术相结合，实现了在线连续测试δ¹³C_DOC值，对于碳含量约3μg的水样，δ¹³C的测试精度优于0.4‰，而对于碳含量约1.2μg的样品，δ¹³C的测试精度优于0.8‰^［17］。这表明该方法结合气体同位素质谱仪，能够快速、准确地测定淡水中的δ¹³C_DOC值。然而，针对岩溶水体中利用湿氧化法测试δ¹³C_DOC值的相关讨论尚不充分。这是由于岩溶地区地表和地下水体中的碳主要以可溶性碳酸盐(Dissolved inorganic carbon，DIC)的形式存在，且水化学类型主要为HCO₃-Ca型^［26-28］；此外，岩溶区水体中DOC含量相对于DIC含量较低^［29］。针对岩溶区水体中高Ca离子是否可能会与氧化剂反应，形成难溶的沉淀，干扰氧化过程；高DIC导致在湿氧化过程中产生大量的CO₂，影响样品中δ¹³C_DOC值的准确测定；低DOC含量影响着湿氧化法可能无法准确测定低含量的样品，这些特性均需要对湿氧化法测定岩溶水体中δ¹³C_DOC值的前处理条件进行相应的优化。因此，本文旨在研究纯水对空白信号的影响、顶空瓶与大气的平衡方式、无机碳去除效果等因素，这些因素可能影响δ¹³C_DOC值的测试结果。通过使用邻苯二甲酸氢钾和碳酸氢钠配制不同溶液，模拟岩溶水体中的DOC和DIC情况，以优化湿氧化法测定岩溶水体δ¹³C_DOC值的前处理条件。同时，利用优化后的湿氧化法测定岩溶水体中δ¹³C_DOC值，并与TOC-IRMS法进行结果比对研究。本文研究目标是明确湿氧化法测试岩溶区水体δ¹³C_DOC值的最佳实验条件，提高该方法的准确度。

1.   实验部分

1.1   样品信息

样品地理位置：采样地点位于浙江省杭州市富阳区万市镇葛溪流域。该流域是钱塘江支流渌渚江的支流，发源于浙江临安市告塘坞村张村坞，流经杭州市富阳区，距离杭州市区直线距离大约在54～76km。流域面积大约400km²，其中碳酸盐岩分布面积约占150km²，涵盖了浙江省所有地质时代的碳酸盐岩地层。在浙西北的葛溪流域采集了2个岩溶水样。样品采集后，使用1000mL聚丙烯灭菌瓶进行灌装，并带回实验室进行过滤处理。随后，将过滤后的样品在4℃低温条件下保存，以备后续测试使用。

1.2   样品前处理方法

湿氧化法的前处理流程如下：①移取4mL样品放入顶空瓶中；②向顶空瓶中加入1mL氧化剂；③加入适量的8.5%磷酸，调节溶液的pH＜3；④使用吹扫装置将顶空瓶中的CO₂吹扫干净；⑤将顶空瓶放置在恒温加热器上，在100℃下加热1h；⑥加热后，将顶空瓶冷却至室温；⑦离心去除瓶盖上的水滴；⑧将处理后的顶空瓶放置在多用途气体样品制备装置样品盘中，平衡后使用气体同位素质谱仪进行测试(图1)。其中吹扫过程分为两步：第一步，在拧上顶空瓶盖子之前，使用氮吹仪先吹扫水样中酸化产生的游离CO₂。为了方便顶空瓶的取放并避免吹气针被腐蚀，氮吹仪的吹气针上装配了聚四氟乙烯软管。第二步，拧上顶空瓶盖子之后，将顶空瓶放置在多用途气体样品制备装置样品盘中，吹扫顶空瓶顶部的空气，以排除顶空瓶中的氧气和其他气体，确保测试的准确性。

图  1  实验流程总体示意图

Figure  1.  Overall diagram of experimental process

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1.3   实验仪器

气体同位素质谱仪(MAT253型，美国ThermoFisher公司)，配套外围设备配有：多用途气体样品制备装置(GasBench Ⅱ型，美国ThermoFisher公司)、元素分析仪(Flash 2000型，美国ThermoFisher公司)，主要用于水样中δ¹³C_DOC分析测试。干式氮吹仪(LC-DCY-24GP型，上海力辰邦西仪器科技有限公司)，主要用于吹扫水样中游离CO₂；干式恒温器(MK200-4型，杭州奥盛仪器有限公司)，主要用于恒温加热样品，使氧化剂氧化水中DOC；百万分之一天平(XP6型，Mettler Toledo公司)；万分之一天平(BS224S型，Sartorius公司)；超纯水仪(Advantage A10型，Merck Millipore公司)。

1.4   主要试剂

溶于水的有机化合物：本实验初选邻苯二甲酸氢钾(KHP)、葡萄糖(C₆H₁₂O₆)作为DOC实验的工作标准物质。邻苯二甲酸氢钾：工作基准试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；葡萄糖，分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；过硫酸钾，优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；磷酸，分析纯，成都市科隆化学品有限公司生产。

纯水：市场上销售的不同类型的水，分别为色谱级水：厦门艾美漫妮生物科技有限公司生产；三次蒸馏水：广州和为医药科技有限公司生产；一级超纯水：广州和为医药科技有限公司生产；无菌双蒸水：LABCOMS公司生产；一次蒸馏水：比克曼生物科技有限公司生产；本实验室超纯水：为Milli-Q Advantage A10超纯水仪制水。选择不同纯水的目的是为了确定能够产生最低空白信号强度的纯水，从而减少对样品检测结果的干扰。

邻苯二甲酸氢钾溶液的配制：①称取2.1273g邻苯二甲酸氢钾，纯水溶于1000mL容量瓶中，定容至刻度，得到含碳量为1g/L的母液；②采用逐级稀释的方法，对1g/L的母液进行稀释，以制备不同含碳量的溶液。首先，将1g/L母液稀释至含碳量为25mg/L的溶液。然后，进一步稀释，分别制备含碳量为15.0、10.0、5.0、2.0、1.0mg/L的溶液。该试剂的使用是为了模拟不同DOC浓度梯度的岩溶水体环境。

碳酸氢钠溶液的配制：称取10.50g碳酸氢钠，纯水溶于1000mL容量瓶中，配制成含7625mg/L的HCO₃ ⁻ 溶液。在岩溶区，水体中通常含有较高浓度的无机碳，尤其是碳酸氢盐(HCO₃ ⁻ )。该试剂的使用是为了模拟岩溶水体中存在无机碳的影响。

邻苯二甲酸氢钾-碳酸氢钠混合溶液的配制：根据岩溶区HCO₃ ⁻ 含量为280.6mg/L，非岩溶区东江水HCO₃ ⁻ 含量为30.5mg/L，混合水HCO₃ ⁻ 含量为219.6mg/L^［30］，本实验模拟水体中HCO₃ ⁻ 的情况^［31］，配制了两种混合溶液A和B。A溶液含有122mg/L的HCO₃ ⁻ 和含碳量为5mg/L的邻苯二甲酸氢钾：分别移取1.25mL含碳量为1g/L的邻苯二甲酸氢钾溶液和4mL 7625mg/L的HCO₃ ⁻ 溶液于250mL容量瓶中，加纯水定容。B溶液含有305mg/L的HCO₃ ⁻ 和含碳量为5mg/L的邻苯二甲酸氢钾：分别移取1.25mL含碳量为1g/L的邻苯二甲酸氢钾溶液和10mL 7625mg/L的HCO₃ ⁻ 溶液于250mL容量瓶中，加纯水定容。

氧化剂的配制：①称取2.00g过硫酸钾放入烧杯中；②加入50mL超纯水并用玻璃棒搅拌使过硫酸钾充分溶解；③加入0.1mL的85%磷酸。配制的氧化剂应在24h内使用，以确保其活性。

1.5   两种标准物质的δ¹³C值标定

碳同位素标准物质：国际原子能标准IAEA-CH-6(δ¹³C=−10.449‰)；国家一级标准物质：GBW04407(δ¹³C=−22.43‰)、GBW04408(δ¹³C=−36.91‰)。

利用元素分析仪和气体同位素质谱仪对邻苯二甲酸氢钾和葡萄糖两种化合物进行标定，主要步骤为：使用4mm×6mm的锡杯称取一定量的碳同位素标准物质和化合物，放入元素分析仪测定碳同位素值。利用碳同位素标准物质的真值和测量值绘制校准曲线(相关系数R=0.999)，测量结果经校准后即为邻苯二甲酸氢钾和葡萄糖的标定参考值。邻苯二甲酸氢钾和葡萄糖的δ¹³C标定参考值分别为−29.76‰和−11.09‰(n=6)。由于岩溶水体的δ¹³C_DOC值主要分布范围为−20‰至−30‰^［15-16］，因此本实验选择邻苯二甲酸氢钾作为可溶于水的化合物进行后续实验。

1.6   方法优化

本实验的目的是优化实验条件以提高检测结果的准确性，方法优化内容：①纯水本底的测试：实验首先评估了不同级别纯水对空白信号的影响。在条件实验中，选择了本底最低的纯水用于配制溶液，以减少实验空白值。②顶空瓶压力平衡：针对顶空瓶吹扫后可能出现的瓶内压力过大的问题，研究了与大气平衡的不同方法：不与大气平衡；使用双头针与大气平衡，其中针管的一头放置在水中，以防止大气倒灌进入顶空瓶；使用一次性注射器的针头手动扎进瓶盖，实现与大气平衡；采用10mL气密针与大气平衡。③通过配制不同浓度的邻苯二甲酸氢钾溶液，检验上述实验条件优化后的实验结果准确性。④模拟岩溶水体中HCO₃ ⁻ 的存在，通过改变磷酸体积和氮吹仪吹扫时间，检验HCO₃ ⁻ 的去除效果。最后，利用优化后的实验条件对岩溶区的2个水样进行检测。将检测结果与TOC-IRMS的检测结果进行对比，以验证优化条件的有效性和可靠性。

1.7   数据处理

检测的结果需要进行空白校正，可以根据质量平衡原理进行校正，校正公式如下：

式中：δ¹³C_T为样品测得δ¹³C值(‰)；δ¹³C_S为样品校正后的δ¹³C值(‰)；δ¹³C_B为空白δ¹³C值(‰)；A_T为测得样品峰面积(Vs)；A_S为样品峰面积(Vs)，即为测得样品峰面积扣除空白峰面积；A_B为空白峰面积(Vs)。

2.   结果与讨论

2.1   不同类型的纯水对空白信号的影响

由于自然水体中DOC含量相对较低，例如河水中DOC含量低至0.4mg/L^［32］，如果空白产生信号强度过高，可能掩盖样品所产生的信号强度，在数据处理时扣除空白峰面积从而导致检测结果的不准确。因此在测定δ¹³C_DOC值的前处理过程中，本底控制对测试结果的准确性起着至关重要的作用。此外，在配制DOC溶液和氧化剂时，使用的纯水质量也会对溶液和化学试剂产生影响。因此，本研究选取了6种不同类型的纯水，以评估它们对空白信号的影响。6种纯水产生的信号强度数据如表1所示。前5种纯水为市售纯水，最后一种为实验室自制的超纯水(电阻率18.2MΩ•cm)。测试结果显示，这6种纯水对空白信号的影响存在显著差异。一级超纯水对空白信号的影响最大，其⁴⁴CO₂峰面积平均值为6.1Vs，而无菌双蒸水对空白信号的影响最小，其⁴⁴CO₂峰面积平均值为1.6Vs，且该纯水三次测量的标准偏差最小，仅为0.1Vs。在本实验中纯水的最大峰面积是最小峰面积的3.8倍，这表明在实验过程中纯水的选择至关重要，它直接影响到低浓度样品测试结果的准确性和后续条件实验的结果。由此可见，湿氧化法不仅可以有效地控制空白信号^［23］，而且通过前期选择合适的纯水，能够进一步降低空白信号对样品信号的影响。并且对于下一步针对DOC含量低于1mg/L的样品的测试提供重要参考依据。在后续实验中，使用无菌双蒸水来配制溶液和洗涤器皿。目前，本实验室仅研究了纯水对空白信号的影响，尚未考虑过硫酸钾和磷酸的级别对空白的影响。在下一步实验中，将开展化学试剂对空白影响的研究，以期将空白信号降至最低。

表  1  不同纯水的⁴⁴CO₂峰面积

Table  1.  The ⁴⁴CO₂ peak areas of different pure water

44CO2峰面积	色谱级水	三次蒸馏水	一级超纯水	无菌双蒸水	一次蒸馏水	实验室超纯水
第1次测定值(Vs)	2.8	2.8	6.8	1.5	6.6	2.1
第2次测定值(Vs)	3.0	3.5	5.3	1.6	5.0	2.3
第3次测定值(Vs)	3.9	2.4	6.2	1.6	5.8	2.4
标准偏差(Vs)	0.6	0.6	0.8	0.1	0.8	0.1
平均值(Vs)	3.2	2.9	6.1	1.6	5.8	2.3
电导率(µm/cm)	0.01	0.01	0.01	0.01	0.1	0.05

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2.2   顶空瓶与大气的平衡方式对信号和δ¹³C_DOC值的影响

在进行高温燃烧法或湿氧化法的空白校正时，需要准确计算空白相对于实际样品的质量贡献。这是因为整个测量系统中由碳量产生的相关峰面积对于获得准确的结果至关重要^［17］。使用GasBench Ⅱ进行氦气吹扫顶空瓶以去除空气时，吹扫后的顶空瓶内压力高于吹扫前的压力，这种正压力可能会影响水样中DOC的氧化释放、样品以及空白信号的强度。本研究通过使用含碳量为25mg/L的邻苯二甲酸氢钾溶液进行实验，并将纯水当作空白样品进行空白监测，四种不同平衡方式结果如图2所示。实验结果表明：不与大气平衡的邻苯二甲酸氢钾溶液产生的⁴⁴CO₂峰面积明显低于与大气平衡的峰面积(图2a)，这可能是由于样品瓶吹扫后高压力的氦气背景使得释放的CO₂被稀释，导致进入气体同位素质谱仪的CO₂体积减少，或者是因为顶空瓶顶部气体压力过大，不利于CO₂的释放。采用双头针平衡方式产生⁴⁴CO₂峰面积最高(图2a)，这可能是因为顶空瓶中的氦气压力与大气完全平衡，导致反应产生的CO₂体积稀释最小，但同时也增加了空白⁴⁴CO₂峰面积(图2b)，这可能会降低DOC含量低的样品数据准确性。手动扎针平衡和气密针扎针平衡产生的⁴⁴CO₂峰面积基本一致，但是采用气密针方法测得的⁴⁴CO₂峰面积重现性最好(图2a)，这可能是因为气密针能够更精确地控制排除气体体积，从而有利于保持每个顶空瓶中气体与大气平衡后的压力基本相同。

图  2  不平衡、双针头平衡、手动扎针平衡和气密针平衡方式对样品⁴⁴CO₂峰面积和δ¹³C_DOC值的影响(图中每种方法4个点代表4份测试样品)

Figure  2.  Effects of unbalanced, dual-needle balancing, manual puncture balancing, and airtight needle balancing methods on the ⁴⁴CO₂ peak areas and δ¹³C_DOC values of the samples (Each method in the graph is represented by four points, indicating four test samples)

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因此，测试样品时采用气密针与大气平衡的方式提供了最好的δ¹³C_DOC值重现性(图2c)，且与邻苯二甲酸氢钾标定参考值偏差最小。不与大气平衡的δ¹³C_DOC值与邻苯二甲酸氢钾标定参考值偏差最大。选择使用气密针与大气平衡的方式可以在增加⁴⁴CO₂峰面积的同时，保持δ¹³C_DOC值具有良好的重现性，从而使得δ¹³C_DOC测定值与标定值之间的偏差最小。这种方法对于提高低DOC含量样品的测试准确性和可靠性具有重要意义。

2.3   DOC含量对δ¹³C_DOC值的影响

岩溶区水体中DOC含量通常具有较大的含量变化范围，其范围通常在0.87～6.89mg/L之间^［29］。在测定自然水体中δ¹³C_DOC值时，结果主要受到空白校正和氧化效率的共同影响^［33］。因此，在实验过程中产生的空白对DOC含量和δ¹³C_DOC值的测定均有一定的影响，这种影响可以通过质量平衡进行校正。本实验通过使用不同浓度的邻苯二甲酸氢钾配制溶液，检测⁴⁴CO₂峰面积扣除空白峰面积后与邻苯二甲酸氢钾溶液含碳量的关系，线性回归系数达到0.9982(图3)。本实验说明不同浓度的邻苯二甲酸氢钾溶液含碳量与⁴⁴CO₂的峰面积呈显著的线性关系，通过⁴⁴CO₂的峰面积大小可以计算出溶解有机碳的浓度，为溶解有机碳的浓度提供参考。

图  3  邻苯二甲酸氢钾溶液含碳量与⁴⁴CO₂峰面积的关系

Figure  3.  Relationship between the carbon content of potassium hydrogen phthalate and ⁴⁴CO₂ peak area

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对于低浓度的邻苯二甲酸氢钾配制溶液未经过空白校正时，δ¹³C_DOC测定值与标定参考值的偏差较大，含碳量为1mg/L、2mg/L、5mg/L的邻苯二甲酸氢钾配制溶液δ¹³C_DOC测定值与标定参考值的偏差分别为2.35‰、1.48‰、0.91‰。然而，经过空白校正后偏差降低，与标定参考值的偏差分别为0.66‰、0.30‰、0.39‰(图4)。这表明空白校正是提高低浓度样品测试结果准确性的关键步骤。对于含碳量达到15mg/L和25mg/L的邻苯二甲酸氢钾配制溶液，两者的测定值与标定参考值基本一致，偏差仅为0.15‰和0.07‰。这说明溶液浓度越高，产生的峰面积越大，空白对其影响就越小。因此，对于低浓度样品，空白校正尤为重要。综上所述，湿氧化方法在处理DOC含量高于2mg/L的样品时，δ¹³C_DOC值测试准确度可以达到0.40‰以内。

图  4  不同含碳量的邻苯二甲酸氢钾的δ¹³C值

Figure  4.  The δ¹³C values of potassium hydrogen phthalate at different carbon concentrations

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2.4   无机碳去除效果对δ¹³C_DOC值的影响

2.4.1   加入磷酸的体积

岩溶区水样具有pH＞7和高HCO₃ ⁻ 含量的特性，其HCO₃ ⁻ 含量在280.6mg/L左右变化^［30］。因此，传统湿氧化法将溶液调至pH＜3，是否能够彻底地消除无机碳对δ¹³C_DOC值的影响，以及加入过量的磷酸是否会导致空白值上升或是否存在其他因素影响测试结果的准确性，这些问题亟需进行深入探讨和明确。因此，在配制122mg/L和305mg/L两种含有HCO₃ ⁻ 的邻苯二甲酸氢钾溶液中，加入浓度为8.5%磷酸使溶液pH＜3，研究加入磷酸体积是否对δ¹³C_DOC值存在影响。本实验设计了加入60μL、100μL和150μL磷酸的实验，每组三个平行样品，结果如图5所示。加入8.5%的磷酸60μL，两种溶液中δ¹³C_DOC值均为−29.43‰左右，说明加入60μL磷酸能够完全去除305mg/L的HCO₃ ⁻ 。随着加入磷酸体积增加，δ¹³C值的变化小于0.15‰(图5中a、b)。理论上，向样品中加入过量磷酸可以更有效地去除样品中的HCO₃ ⁻ 。然而，在确保完全去除样品中HCO₃ ⁻ 的同时，应避免加入过量的磷酸，以防止由此引起的空白信号增加。因此，邻苯二甲酸氢钾溶液在使用磷酸酸化时，pH＜3即可满足实验需求。

图  5  磷酸体积对δ¹³C_DOC值的影响

Figure  5.  Effect of phosphoric acid volume on δ¹³C_DOC value

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2.4.2   氦气吹扫时间

在岩溶区，通过溶蚀过程，大气和土壤中的CO₂持续转化为岩溶水体中的HCO₃ ⁻ 。然而，HCO₃ ⁻ 的稳定性较差，部分HCO₃ ⁻ 会分解并释放出游离CO₂进入水体^［34］。与此同时，岩溶水体中DIC含量较高，在酸化过程中也会释放出一部分CO₂溶解于水体中。因此，根据岩溶区水样HCO₃ ⁻ 含量和游离CO₂的特点，利用碳酸氢钠配制了122mg/L和305mg/L两种含HCO₃ ⁻ 的邻苯二甲酸氢钾溶液，使用氮吹仪在流速为250mL/min进行吹扫，分别吹扫5min、10min、15min。经空白校正后的δ¹³C_DOC结果如图6，对于含有相同浓度HCO₃ ⁻ 的溶液，吹扫5min和吹扫10min的δ¹³C_DOC值测试结果基本一致(图6中a，b)，这可能是因为氮吹仪的流速相对比较高，5min就能将溶液中氧化DOC所释放的CO₂吹扫干净。对于含有较高浓度的305mg/L HCO₃ ⁻ 溶液，使用5min同样也能将溶液中氧化DOC所释放的CO₂吹扫干净。当吹扫15min时，两种溶液中的δ¹³C_DOC值均出现逐渐偏正的现象，这可能是因为氮吹仪的流速过高，吹扫时间过长导致溶液中富集¹²C易挥发的有机质损失，从而使δ¹³C_DOC值的检测结果偏重。

图  6  不同的吹扫时间对δ¹³C_DOC值的影响

Figure  6.  Effect of different blowing time on δ¹³C_DOC value

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由此可见，选择合适的吹扫时间能够有效地减少在高纯氦气吹扫无机碳过程中，在室温下易潮解或在低pH值条件下易挥发的有机物被吹扫出去，从而避免这些因素对DOC测定结果的影响^［18］。因此使用氮吹仪进行CO₂吹扫时，将时间控制在5～10min。

2.5   湿氧化法在岩溶区水样的应用

采样点位于浙江省杭州市富阳区万市镇的葛溪流域。该流域覆盖了浙江省内各个时代的碳酸盐岩地层。此外，采样点未受到人为活动的干扰，因此DOC含量没有异常，确保了所采集样品能够代表岩溶水体的特性。在采集的2个水样(样品编号为W1、W2)中，其HCO₃ ⁻ 含量分别为168.97mg/L、183.61mg/L，DOC含量分别为1.20mg/L、1.40mg/L。在比较TOC-IRMS方法和湿氧化法进行δ¹³C_DOC值测定时，两种方法的结果显示了较高的一致性(表2)。其中TOC-IRMS测定的δ¹³C_DOC值分别为−25.38‰、−25.12‰，而湿氧化法测定每个样品三次，其结果与TOC-IRMS测定结果的最大差值分别为0.29‰和−0.28‰，表明湿氧化法在测定δ¹³C_DOC值时具有较高的准确性和重复性。

表  2  岩溶区样品DOC的δ¹³C_DOC值

Table  2.  The δ¹³C_DOC values in karst area samples

样品编号	本实验δ13CDOC测试结果(‰)		标准偏差（‰）	TOC-IRMS法δ13CDOC测定值（‰）	两种方法 差值(‰)
	测定值	平均值
W1	−25.24	−25.19	0.09	−25.38	0.14
	−25.24				0.14
	−25.09				0.29
W2	−25.40	−25.32	0.09	−25.12	−0.28
	−25.35				−0.23
	−25.22				−0.10

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本文优化的湿氧化法测定岩溶区水样与TOC-IRMS测定结果之间存在一定差异。这可能是δ¹³C_DOC在测试过程中，不同分析方法引入的系统误差，或者样品的保存条件对测试结果产生影响。因为样品在存放过程中，由于微生物的作用，δ¹³C_DOC值可能会发生变化。研究表明，内源性DOC可以支持一定比例的细菌生长代谢活动，DOC是微生物代谢活动的主要能量来源^［35-37］。岩溶区水体中DOC主要来自于水生物的初级生产力、外源水和水生生物作用对无机碳的吸收转化。水生植物、浮游植物及自养微生物光合作用生成的DOC可以被水体中的异养微生物降解矿化再次形成CO₂释放到大气中^［38-40］。

因此，为了减少微生物活动对DOC值的影响，采集的样品应尽快经过0.45μm的滤膜过滤，并在4℃温度下保存，以减缓微生物的活动。这些措施有助于保持样品的原始状态，减少测试误差，确保δ¹³C_DOC值测定结果的可靠性。

3.   结论

针对岩溶水体的特性，即pH＞7、高HCO₃ ⁻ 含量和低DOC含量，对传统的湿氧化法进行了优化。通过条件实验选择的纯水降低了空白对测试结果产生影响，δ¹³C_DOC检测结果经过空白校正后，能提高检测结果的准确性。此外，确定了适合岩溶水样的最佳酸化条件、吹扫时间和平衡方式，以消除游离CO₂及氧化反应产生的CO₂对结果的影响。在控制空白样品信号强度的同时，提高了水样中δ¹³C_DOC测量的信号强度，确保了测试结果的准确性。经过优化实验条件，该方法不仅能够有效地应用于实际样品的分析测试，还实现了对试剂用量的有效控制。

本文针对岩溶区水体中δ¹³C_DOC值的测试，对湿氧化法进行了优化，以避免空白信号、平衡方式、无机碳去除等因素对测试结果的干扰。然而，对于DOC含量低于1mg/L的极低含量自然水样的前处理方法，可以通过低温浓缩来提升水样中单位体积DOC的含量，但实验条件尚需进一步探究和优化。

致谢： 感谢审稿人对本文提出的建设性修改意见和指导。